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Apr 30, 2023

Structure et mécanisme du transporteur d'oxalate OxlT dans un oxalate

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1730 (2023) Citer cet article

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Une bactérie dégradant l'oxalate dans le microbiote intestinal absorbe l'oxalate d'origine alimentaire pour l'utiliser comme source de carbone et d'énergie, réduisant ainsi le risque de formation de calculs rénaux chez les animaux hôtes. Le transporteur bactérien d'oxalate OxlT absorbe sélectivement l'oxalate de l'intestin vers les cellules bactériennes avec une discrimination stricte des autres carboxylates nutritifs. Ici, nous présentons des structures cristallines d'OxlT lié à l'oxalate et sans ligand dans deux conformations distinctes, états occlus et tournés vers l'extérieur. La poche de liaison au ligand contient des résidus basiques qui forment des ponts salins avec l'oxalate tout en empêchant le passage conformationnel à l'état occlus sans substrat acide. La poche occluse peut contenir de l'oxalate mais pas des dicarboxylates plus gros, tels que des intermédiaires métaboliques. Les voies de perméation à partir de la poche sont complètement bloquées par des interactions interdomaines étendues, qui ne peuvent être ouvertes que par un retournement d'une seule chaîne latérale voisine du substrat. Cette étude montre les bases structurelles sous-jacentes aux interactions métaboliques permettant une symbiose favorable.

L'oxalate est le plus petit dicarboxylate (C2O42–) ingéré par notre alimentation quotidienne à partir d'aliments contenant de l'oxalate1, comme les légumes, les haricots et les noix2. L'oxalate est également un produit métabolique final dans notre corps et est en partie sécrété dans l'intestin via la circulation systémique1. Ensuite, il est absorbé par le tractus intestinal et excrété par le rein3. Cependant, un excès d'oxalate forme un sel insoluble avec le calcium sanguin et provoque une maladie des calculs rénaux (Fig. 1a). Oxalobacter formigenes est une bactérie dégradant l'oxalate dans l'intestin4 qui peut décomposer métaboliquement l'oxalate intestinal et contribue ainsi de manière significative à l'homéostasie de l'oxalate chez les animaux hôtes, y compris les humains3,5,6. En effet, les patients atteints de mucoviscidose7 ou de maladie intestinale inflammatoire8 ou ceux qui ont subi un pontage jéjuno-iléal9 sont connus pour avoir de faibles taux de colonisation par O. formigenes et un risque accru d'hyperoxalurie et de formation de calculs rénaux.

a Dessin schématique de la fonction OxlT dans la bactérie dégradant l'oxalate, O. formigenes, dans l'intestin. b, c Structures cristallines liées à l'oxalate (PDB ID 8HPK; b) et sans ligand (PDB ID 8HPJ; c) OxlT. d Superposition d'OxlT lié à l'oxalate et sans ligand. Une vue du périplasme (en haut) et deux vues dans le plan transmembranaire (en bas) sont présentées. e, f Carte de potentiel électrostatique de surface d'OxlT lié à l'oxalate (e) et sans ligand (f). Des potentiels électrostatiques à ±5 kTe−1 ont été cartographiés sur les surfaces.

Le transporteur d'oxalate (OxlT), un antiporteur oxalate:formiate (OFA)10 chez O. formigenes, est une molécule clé pour le métabolisme de l'oxalate chez cette bactérie. OxlT catalyse l'antiport des carboxylates à travers la membrane cellulaire en fonction de leurs gradients électrochimiques avec une spécificité de substrat optimisée pour le dicarboxylate C2, l'oxalate. En effet, le transporteur montre un taux de rotation élevé (>1000/s) pour l'auto-échange d'oxalate11,12. Dans des conditions physiologiques chez l'oxalate autotrophe O. formigenes, la fonction d'échange de carboxylate d'OxlT permet l'absorption d'oxalate de l'intestin de l'hôte comme seule source de carbone pour la bactérie et une libération de formiate (HCO2–), le produit final de dégradation de l'oxalate qui est toxique s'il s'accumule dans la cellule bactérienne11,12,13 (Fig. 1a). Le renouvellement catalytique OxIT de l'échange oxalate:formiate s'accompagne de la dégradation métabolique de l'oxalate en formiate via une décarboxylase qui consomme un proton dans le cytosol, produisant par conséquent un gradient électrochimique de protons à travers la membrane cellulaire bactérienne11. Par conséquent, OxlT sert de «pompe à protons virtuelle» qui crée une force motrice de protons pour la synthèse bactérienne d'ATP11. Ainsi, les caractéristiques fonctionnelles d'OxlT en tant qu'antiporteur entre l'oxalate et le formiate, plutôt qu'un uniporteur de chaque produit chimique, sont essentielles pour coupler le métabolisme du carbone et la formation d'énergie. Notamment, OxlT n'accepte pas l'oxaloacétate (C4H2O52-) ou le succinate (C4H4O42-), qui sont des intermédiaires dicarboxylates du cycle de Krebs, comme substrats13. Ces dicarboxylates à quatre atomes de carbone (dicarboxylates en C4) sont des intermédiaires métaboliques importants du côté cytosolique bactérien alors qu'ils sont également absorbés en tant que sources d'énergie et précurseurs biosynthétiques par un transporteur intestinal du côté de la lumière de l'hôte14. Par conséquent, la capacité d'OxlT à faire la distinction entre les dicarboxylates C2 et C4 est essentielle pour la symbiose favorable entre les animaux hôtes et la bactérie intestinale.

OxlT appartient à la superfamille des grands facilitateurs (MFS), la grande famille des transporteurs dont les membres transportent un large éventail de produits chimiques10. Les protéines MFS partagent une architecture commune de douze hélices transmembranaires (TM) qui contiennent des moitiés N- et C-terminales symétriques de six unités TM dupliquées par des gènes, avec un site de liaison au substrat au centre de la molécule15,16. Le mécanisme de transport du substrat de la famille MFS ainsi que d'autres familles de transporteurs s'explique par le «modèle d'accès alterné»17, dans lequel les molécules de transport ouvrent alternativement une cavité du site de liaison à chaque côté de la membrane, et prennent alternativement face à l'extérieur, conformations occluses et tournées vers l'intérieur via un mouvement « à bascule » des domaines N- et C-terminaux, permettant ainsi le transfert du substrat à travers la membrane18,19,20. Bien qu'une mine d'informations structurelles de chaque membre MFS ait été accumulée, les connaissances actuelles sur la famille OFA restent limitées à une structure OxlT initialement résolue par cristallographie électronique à 6,5 Å21,22. Par conséquent, la reconnaissance spécifique de l'oxalate et le mécanisme antiport d'OxlT doivent encore être élucidés dans une structure à plus haute résolution.

Dans cette étude, nous rapportons les structures cristallographiques aux rayons X d'OxlT sous des formes liées à l'oxalate et sans ligand résolues à 3, 0–3, 3 Å pour comprendre la base structurelle de ces fonctions de transport clés qui sous-tendent la symbiose de cette bactérie dégradant l'oxalate dans l'intestin.

L'OxlT de type sauvage est instable dans diverses conditions, comme en présence d'ions chlorure12,23, ce qui réduit considérablement l'espace chimique disponible pour le criblage par cristallisation. Pour l'étude structurale d'OxlT, une stratégie de cristallisation assistée par anticorps a été adoptée. En général, les fragments d'anticorps Fab ou Fv qui se lient spécifiquement aux épitopes conformationnels dans les protéines membranaires peuvent augmenter la surface hydrophile disponible pour la formation de réseaux cristallins rigides. De plus, les fragments d'anticorps liés peuvent réduire la flexibilité inhérente des protéines et l'hétérogénéité conformationnelle, augmentant la probabilité d'une cristallisation réussie des protéines membranaires24,25. OxlT a été stabilisé en liant deux fragments d'anticorps différents, ce qui a entraîné une cristallisation dans deux conditions différentes. Nous avons confirmé que les fragments d'anticorps utilisés pour la cristallisation se lient à OxlT à la fois en présence et en l'absence d'oxalate (Fig. 1 supplémentaire). Par conséquent, il est peu probable que les fragments d'anticorps piègent artificiellement OxlT dans une conformation particulière. La structure cristalline de l'OxlT lié à l'oxalate en complexe avec le fragment Fab a été résolue à 3, 0 Å (PDB ID 8HPK) tandis que celle de l'OxlT sans ligand en complexe avec un fragment Fv a été résolue à 3, 3 Å (PDB ID 8HPJ) (Fig supplémentaire 2a, b et tableaux supplémentaires 1 et 2).

La structure globale d'OxlT se compose de 12 hélices TM (Fig. 1b, c), comme observé dans la structure EM précédente21 et confirmé plus tard comme une architecture MFS typique15,16. À l'état lié à l'oxalate, la protéine OxlT adopte une conformation occluse avec une molécule d'oxalate se liant au centre de la structure (Fig. 1b, e). En revanche, l'OxlT sans ligand prend une conformation sensiblement différente de la forme liée à l'oxalate (Fig. 1c, d, f). La protéine OxlT présente une grande cavité en forme de V entre les domaines N- (TM1–6) et C-terminal (TM7–12), qui est connectée du site central de liaison de l'oxalate au périplasme, une signature claire d'un vers l'extérieur. - conformation de face.

Dans une comparaison des structures occluses et tournées vers l'extérieur, l'écart quadratique moyen (RMSD) de Cα pour tous les résidus était de 2, 6 à 2, 7 Å (Fig. 1d). Même les seuls domaines N- ou C-terminaux des deux ont montré des différences structurelles considérables (Cα RMSD d'environ 1, 5 à 1, 6 Å). Par conséquent, le changement structurel entre les états occlus et tourné vers l'extérieur avec un mouvement « d'interrupteur à bascule » n'est pas obtenu par l'inclinaison des unités structurelles rigides mais est concomitant avec leur flexion. En effet, des courbures bien visibles au niveau de la partie périplasmique sont observées sur TM1, 2, 4, 7, 8 et 11 dans la structure tournée vers l'extérieur, avec inclinaison des autres hélices TM environnantes (Fig. 1d). En revanche, il n'y avait pas de différences notables dans la partie cytoplasmique entre les deux conformations. Dans d'autres protéines MFS, telles que GLUT5 et NarK, une flexion au niveau des résidus glycine dans les hélices TM a été observée entre les différents états conformationnels26,27. OxlT a 52 résidus glycine, ce qui représente environ un huitième (12,4%) de la teneur en acides aminés (Fig. 1d, Fig. 2c, d et 3 supplémentaires). Notamment, cette fréquence de glycine est supérieure à celle d'autres protéines MFS, telles que LacY (8,6 %), GLUT5 (7,6 %) ou NarK (10,4 %), et dans les hélices TM d'autres protéines membranaires (~ 8,7 %)28. Par conséquent, l'accumulation de courbure des hélices TM au niveau des résidus glycine apparaît plus importante dans la réalisation du changement de conformation entre les états dans OxlT. Des résidus de glycine ont également été trouvés à l'interface entre les domaines N- et C-terminaux comme dans TM5 et TM8 ou TM2 et TM11 (Fig. 2c, d supplémentaires) et ont obtenu un emballage hélicoïdal serré comme indiqué précédemment 28,29. L'occurrence élevée de glycine observée dans OxlT peut être nécessaire pour occlure l'oxalate, qui est petit pour un substrat transporté, au centre de la molécule. Inversement, l'architecture riche en glycine est probablement responsable de l'instabilité d'OxlT dans les micelles détergentes, ce qui empêche la cristallisation en l'absence de fragments d'anticorps et d'essais fonctionnels, comme décrit ci-dessous. Le rapport élevé de glycine a également été observé dans les autres protéines OFA (10, 2 ± 1, 1% avec 15 positions strictement conservées; observé chez 11 membres de la famille illustrés à la Fig. 3 supplémentaire) et peut être un trait familial.

Dans la structure cristalline (PDB ID 8HPK), la molécule d'oxalate se liant à OxlT est raffinée sous la forme d'une configuration torsadée (Fig. 2a et Fig. 4a supplémentaire). La liaison entre les deux groupes carboxyle dans un dianion oxalate est connue pour être simple et non conjuguée, permettant une rotation libre des groupes carboxyle autour de la liaison CC30. Étant donné que la résolution de la structure OxlT liée à l'oxalate est insuffisante pour déterminer avec précision l'angle dièdre de l'oxalate, nous avons effectué des calculs de mécanique quantique (QM) et de mécanique quantique / mécanique moléculaire (QM / MM) de la liaison de l'oxalate dans la structure OxlT occluse à examiner la conformation énergétiquement minimisée. Les angles dièdres OCCO résultants dans l'oxalate étaient compris entre 50 et 68 ° (Fig. 4b, c et tableau supplémentaire 3). Ces valeurs sont proches de celles observées dans la structure cristalline d'origine (60,1˚), vérifiant que l'oxalate n'est pas plan mais tordu dans la structure cristalline.

a Gros plan du site de liaison dans OxlT lié à l'oxalate (PDB ID : 8HPK). Les lignes pointillées indiquent les liaisons hydrogène potentielles et les ponts salins. Également montré une vue agrandie de la molécule d'oxalate liée avec des étiquettes d'atome. b Superposition des structures du site de liaison au substrat de OxlT (avec les étiquettes soulignées) et NarK (vert, avec des étiquettes normales ; ID PDB : 4U4W) en fonction de la similitude topologique des résidus d'acides aminés interagissant avec les substrats. c Test de liaison à l'oxalate par GFP-TS. Les données représentent les moyennes ± SEM des augmentations des températures de fusion provoquées par l'ajout d'oxalate de potassium 3 mM dans trois expériences indépendantes. WT : type sauvage. d Essai d'absorption d'oxalate à l'aide de cellules recombinantes d'E. coli. Les activités de transport relatives du mutant OxlT à celle du WT OxlT mesurée le même jour fixée à 100%, tandis que celle des cellules n'exprimant pas OxlT36 a été fixée à 0%, sont affichées. Les barres représentent les moyennes des mesures techniquement dupliquées à partir d'une seule expérience pour chaque mutant. Les résultats des mutants R272A et K355Q sont republiés de l'étude précédente36 à des fins de comparaison. e Essai d'absorption d'oxalate de protéoliposome. Les concentrations d'oxalate résultantes dans les lysats de liposomes ont été mesurées et normalisées à celles du WT OxlT à 60 min. Les résultats des liposomes sans OxlT sont présentés comme "vides". Les barres représentent les moyennes des résultats dans trois (données à 0 min et 60 min pour vide, WT et R272A) ou deux (autres) expériences indépendantes. au : unité arbitraire. Dans les panneaux c et e, les données ont été analysées par une analyse de variance unilatérale bilatérale avec le test de Dunnett avec le WT OxlT comme contrôle, et les valeurs P exactes sont fournies dans le tableau supplémentaire 6. * P < 0,05, * *P < 0,01, ***P < 0,001. Les barres rouges indiquent les mutants (ou mutations au même résidu) présentant une perte d'activité dans les études précédentes31,32,34. f Interactions interdomaines fermant la cavité au cytoplasme. g Réseau d'interaction ionique du côté cytoplasmique d'OxlT. h Interactions interdomaines fermant la cavité au périplasme.

Au site de liaison dans OxlT, l'oxalate se lie au transporteur avec un groupe carboxyle formant un pont salin bidenté avec Arg272 dans TM8 tandis que l'autre forme une interaction ionique avec Lys355 dans TM11 (Fig. 2a). En plus du pontage salin avec l'oxalate, le groupe ε-amino dans Lys355 forme un réseau de liaisons hydrogène interdomaine avec les groupes carboxamide dans Gln34 (TM1) et Gln63 (TM2) dans le domaine N-terminal. De même, le groupe guanidino dans Arg272 forme une liaison hydrogène interdomaine avec le groupe carbonyle de la chaîne principale dans Ala147 (TM5) et interagit en outre avec le carboxamide de la chaîne latérale et le groupe carbonyle de la chaîne principale de Asn268 en amont de TM8. La région autour de Arg272 est le point de flexion dans TM8 en raison de la séquence de N268GGCR272P, et donc les liaisons hydrogène entre Arg272 et Asn268 maintiennent probablement la conformation et l'orientation de TM8 dans la structure liée à l'oxalate. Ces réseaux de liaisons hydrogène inter et intra-domaine impliquant Arg272 et Lys355 jouent probablement un rôle central dans l'organisation de la structure de la poche de liaison et la stabilisation de la conformation occluse, malgré la localisation de ces deux résidus basiques dans le domaine C-terminal. Ces deux résidus basiques sont conservés au sein de la famille OFA (Fig. 3 supplémentaire), sont essentiels pour le transport de l'oxalate, et même les mutations R272K ou K355R réduisent l'activité de transport31,32,33. Ces résultats confirment les observations selon lesquelles non seulement les charges mais aussi les structures chimiques des chaînes latérales des deux résidus sont importantes pour l'organisation structurelle du site de liaison.

En plus des deux résidus basiques, de nombreux résidus aromatiques contribuent à la liaison de l'oxalate. Les groupes hydroxyle de Tyr35 et Tyr124 forment des liaisons hydrogène avec l'un ou l'autre des groupes carboxyle de l'oxalate (Fig. 2a). De plus, les groupes de chaînes latérales aromatiques dans Tyr150, Trp324, Tyr328 et Trp352 forment des interactions π-π face à face ou bord à face avec les groupes carboxyle dans l'oxalate, indiquant l'importance des systèmes d'électrons π dans l'oxalate pour reconnaissance moléculaire par OxlT. Ces résidus aromatiques répartis dans les moitiés N- et C-terminales, et donc leurs interactions avec l'oxalate stabilisent également la fermeture des cavités interdomaines pour obtenir la conformation occluse. De plus, Trp352 (TM11) forme une liaison hydrogène interdomaine avec Gln66 (TM2). Ces résidus aromatiques sont conservés parmi les protéines appartenant à la famille OFA (Fig. 3 supplémentaire). En effet, des mutations au niveau de Tyr150 ou Trp352 ont été liées à la perte des fonctions de transport dans des études antérieures31,34. Notamment, une combinaison similaire d'interactions ioniques et π-π a été observée avec la reconnaissance du nitrate, qui possède également un système d'électrons π, par NarK dans la famille des porteurs nitrate/nitrite (NNP)26,29, bien que la famille NNP soit éloignée de la famille OFA10 et les positions des résidus impliqués ne correspondent pas (Fig. 2b).

L'importance des résidus mentionnés ci-dessus ou de leurs voisins pour la liaison et le transport de l'oxalate a été étudiée. Étant donné que l'OxlT purifié est instable, en particulier en l'absence de substrat, nous avons utilisé une variété de tests fonctionnels : (1) le test de décalage thermique GFP (GFP-TS)35 pour évaluer la capacité de liaison de l'oxalate, en utilisant le brut solubilisé au détergent. Protéine de fusion OxlT-GFP contenant des lipides provenant des cellules E. coli hôtes; (2) un test de transport in cellulo utilisant des cellules E. coli exprimant OxlT36 de manière recombinante ; et (3) un test de transport in vitro utilisant des protéoliposomes reconstitués avec l'OxlT purifié. Dans le test GFP-TS, l'OxlT de type sauvage a présenté une stabilisation thermique lors de la liaison à l'oxalate. En revanche, l'étendue de la stabilisation thermique dépendante de l'oxalate a été réduite dans les protéines mutantes OxlT Q34A, Y35A, Y124A, Y150A, N268A, R272A, W324A et K355Q (Fig. 2c). Étant donné que les thermostabilités des protéines mutantes OxlT n'étaient pas significativement différentes de celles de l'OxlT de type sauvage en l'absence d'oxalate (Fig. 5 supplémentaire), ces résultats suggéraient que la mutation au niveau des résidus entraînait une réduction de l'affinité de liaison de l'oxalate et / ou stabilité réduite de la structure liée. Dans le test de transport in cellulo, l'étendue de l'échange d'oxalate-formiate par OxlT dans les cellules d'E. coli, qui est négativement électrogène, a été évaluée par un transfert de proton vers l'intérieur induit par la lumière couplé par une xénorhodopsine co-exprimée et l'augmentation résultante du pH de la solution externe36 (Fig. 2d). En plus des mutants non fonctionnels R272A et K355Q31,32, dont la perte d'activité avait été vérifiée dans notre étude précédente36, les mutations OxlT avec Q34A, Y35A, N268A, W324A, Y328A et W352A réduisaient également l'activité (Fig. 2d). Enfin, le test de transport in vitro utilisant l'OxlT purifié reconstitué en protéoliposomes a été réalisé pour R272A et les mutants qui n'ont pas été testés par cette méthode dans les études précédentes (Fig. 2e et Fig. 6 supplémentaire). Une tendance similaire a été observée entre le protéoliposome et dans les dosages cellulo, malgré quelques petits écarts dus aux différences entre les deux systèmes. Curieusement, alors que la plupart des mutants ont démontré une diminution des activités de liaison et de transport, les mutations Y124A et W324A n'ont eu aucun effet significatif sur les activités de transport, au moins dans l'un ou l'autre des tests de transport, malgré la capacité de liaison réduite de l'oxalate. Ces observations peuvent s'expliquer par le fait que la diminution de l'affinité peut entraîner une accélération de l'absorption nette en raison d'un compromis débit-affinité et/ou d'un efflux de substrat réduit37. En revanche, Y328A et W352A ont montré une liaison d'oxalate similaire mais des activités d'absorption d'oxalate réduites par rapport à l'OxlT de type sauvage, indiquant l'importance de ces résidus sur le renouvellement catalytique. Par conséquent, les résultats des études fonctionnelles suggèrent que les résidus à proximité de l'oxalate lié dans la structure OxlT jouent un rôle important dans la liaison et/ou le transport de l'oxalate.

Les interactions entre le substrat et les résidus dans la structure cristalline OxlT occluse sont optimisées pour l'oxalate de dicarboxylate C2. Étant donné que la molécule d'oxalate s'adapte étroitement à la poche de liaison, le remplacement de l'oxalate par un dicarboxylate plus grand, tel que les intermédiaires du cycle de Krebs, provoque des conflits stériques avec les résidus dans OxlT, déstabilisant probablement la conformation occluse (Fig. 7a supplémentaire). Une étude d'amarrage flexible a abouti à une position qui pourrait accueillir un dicarboxylate C3, le malonate, dans le site de liaison de l'OxlT occlus, bien que cela ait eu moins d'interactions par rapport au cas de l'oxalate, en raison du réarrangement des résidus d'acides aminés dans la poche de liaison. (Fig. 7b supplémentaire). Ceci est cohérent avec la diminution de l'affinité et de l'activité de transport pour le malonate avec une valeur Kd de 1,2 mM par rapport à 0,02 mM pour l'oxalate13. Même avec un amarrage flexible, aucune pose pour la liaison des dicarboxylates C4 à l'OxlT occlus n'a été observée, conformément à un rapport précédent indiquant que ces molécules n'entrent pas en compétition de manière significative avec l'oxalate pour l'absorption par OxlT13. Le test GFP-TS a confirmé la plus grande spécificité de l'oxalate pour OxlT ; la stabilisation thermique de OxlT a été observée de manière prédominante en présence d'oxalate (C2) mais pas en présence de malonate (C3) ou de succinate (C4) (Fig. 7c supplémentaire).

Du site de liaison de l'oxalate au cytoplasme ou au périplasme, des interactions intramoléculaires étendues ont été observées entre les hélices TM dans les domaines N- et C-terminaux, tels que TM2 et TM11, TM5 et TM8, les moitiés périplasmiques de TM1 et TM7, et le moitiés cytoplasmiques de TM4 et TM10 (Fig. 2f – h). Ces interactions stabilisent la fermeture des cavités interdomaines dans la structure occluse.

Du côté cytoplasmique sous le site de liaison de l'oxalate, des interactions hydrophobes impliquant Met128 (TM4), Pro332 (TM10) et Tyr348 (TM11) ont été observées, suivies d'interactions polaires entre Asn129 (TM4) et Ser344 (TM11), Arg133 (TM4) et les groupes carbonyle de la chaîne principale de Thr341 et Ala342 (TM11) (Fig. 2f). Ces interactions sont en outre soutenues par des interactions charge-dipôle à l'extrémité cytoplasmique, formées entre Asp78 (TM2) ou Asp280 (TM8) et les extrémités N-terminales de TM11 ou TM5, respectivement (Fig. 2g). Les deux résidus aspartate sont situés dans les motifs `` A-like '' dans les régions TM2-3 (séquence 'G74YFVD78KFGP82R83IP', AL2-3) ou TM8-9 (G276FVSD280KIGR284YK, séquence, AL8-9) (Fig. 3 supplémentaire). Le motif A est l'un des motifs couramment conservés dans les protéines MFS, et le D( + 5) est connu pour participer à des interactions dipolaires charge-hélice interdomaines38. Notamment, ces résidus d'aspartate composent en outre de vastes réseaux d'interaction ionique du côté cytoplasmique (Fig. 2g). Plus précisément, Asp78 et Arg133 dans TM4, et les résidus en aval Asp137 et Arg16 dans TM1, forment des ponts salins. Plus en aval, Arg139 à l'extrémité N-terminale de TM5 forme un réseau de relais de charge avec Asp337, Arg284 et Asp280.

Du côté périplasmique au-dessus du site de liaison de l'oxalate, une liaison hydrogène entre Thr38 (chaîne latérale) dans TM1 et Val240 (squelette) dans TM7 (2, 72 Å) ferme le tunnel des pores dans la conformation occluse (Fig. 2h). Au-dessus de la liaison hydrogène, Leu39 (TM1), Leu52 (TM2), Val244 et Pro245 (TM7) et Val261 (TM8) forment des interactions hydrophobes.

Contrairement au site de liaison au substrat occlus dans l'OxlT lié à l'oxalate, une grande cavité allant du site de liaison à l'espace périplasmique est ouverte dans l'OxlT sans ligand (PDB ID 8HPJ; Fig. 1f). Au site de liaison vide, la chaîne latérale Lys355 se détache de Arg272 en raison de la répulsion de charge et décale les positions de celles trouvées dans la forme liée à l'oxalate (Fig. 3a). Dans la forme sans ligand, la plupart des liaisons hydrogène interdomaines observées à l'état lié à l'oxalate sont conservées. Cependant, celui entre Lys355 dans le domaine C-terminal et Gln34 dans le domaine N-terminal est probablement perturbé à l'état sans ligand, à en juger par la distance entre les chaînes latérales (> ~ 4 Å). Des changements de position des résidus aromatiques environnants, tels que Tyr35, Tyr150, Trp324 et Tyr328, ont également été observés (Fig. 3b). Ces changements au niveau du site de liaison au substrat dus à l'absence d'oxalate sous-tendent probablement le réarrangement structurel de l'architecture globale et entraînent le changement de conformation entre l'état occlus et orienté vers l'extérieur. Notamment, la cavité s'ouvrant sur le périplasme présentait une vaste surface chargée positivement (Figs. 1f et 3c). Cette propriété de base est principalement dérivée de Arg272 et Lys355 dans le site de liaison. De plus, les groupes amino de la chaîne latérale dans Lys45 et Arg248 et les groupes amide dans Gln34, Asn42, Gln56, Asn264, Asn265 et Asn268, qui tapissent cette cavité, sont maintenant exposés au solvant. Ces groupes et les moments dipolaires positifs des hélices coudées de TM1, TM5 et TM11 contribuent également à la propriété fondamentale de l'ensemble de la cavité (Fig. 3c). La répulsion de charge causée par Arg272 et Lys355 au niveau du site de liaison du ligand vide ainsi que la surface de base étendue de la cavité empêchent probablement la fermeture de la poche à la forme occluse en l'absence d'oxalate, stabilisant ainsi un état ouvert. La stabilité d'une conformation à l'état ouvert en l'absence de substrat, qui empêche la transition vers l'état occlus, sous-tend la fonction OxlT en tant qu'antiporteur, dans laquelle le changement de conformation en l'absence de substrat pendant le processus catalytique est interdit22,38. Une situation similaire a été observée sur un antiporteur nitrate/nitrite NarK29, où la surface chargée positivement de la cavité ouverte a stabilisé la conformation tournée vers l'intérieur26.

a Gros plan du site de liaison dans OxlT sans ligand (ID PDB : 8HPJ) vu de la même orientation sur la figure 2a. Le codage couleur du domaine est comme sur la figure 1c. Les lignes pointillées indiquent les liaisons hydrogène potentielles. b Superposition des structures du site de liaison au substrat d'OxlT sous des formes liées à l'oxalate et sans ligand. c Gros plan de la cavité ouverte sur le périplasme. Des modèles de résidus polaires exposés à la cavité et à la surface colorée avec la carte de potentiel électrostatique à ±5 kTe−1 sont également présentés. Dans les panneaux a à c, la molécule définie comme la chaîne A est représentée en tant que représentant.

D'autre part, la partie cytoplasmique de la structure OxlT sans ligand ne montre aucun changement significatif par rapport à celle de la structure liée à l'oxalate (Fig. 1d).

Pour aborder la dynamique structurelle d'OxlT permettant le changement de conformation nécessaire au cycle de transport, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire (MD) basées sur les structures cristallines OxlT occluses liées à l'oxalate et sans ligand tournées vers l'extérieur.

Nous avons d'abord simulé la liaison de l'oxalate à la conformation sans ligand tournée vers l'extérieur (PDB ID 8HPJ) en positionnant l'oxalate à l'extérieur de la protéine (Fig. 4a – c et Fig. 8 supplémentaire). Au niveau de Gln34, Tyr35, Arg272, Tyr328 et Lys355, la liaison des ions oxalate au site de liaison de OxlT a été observée (Fig. 4b). La distance entre les centres géométriques de l'ion oxalate et les résidus du site de liaison, avec une distance de coupure de 5 Å, a déterminé la liaison (Fig. 4c). L'interaction de l'ion oxalate avec Lys355 a résolu sa répulsion de charge avec Arg272 sous la forme sans ligand et a restauré la configuration de la chaîne latérale à partir de l'état inversé. La liaison rapide de l'ion oxalate chargé négativement est facilitée par une vaste surface chargée positivement (Figs. 1f et 3c). La stabilité de la conformation liée dépendait de l'état de protonation de Lys355 (voir Méthodes de calcul du pKa), qui peut être influencé par le pH luminal dans l'intestin, qui varie de 5 à 8 par région40, et l'environnement hydrophobe dans le site de liaison41 . Pour le Lys355 protoné, un seul événement de liaison a été observé et l'ion oxalate lié est resté principalement dans le site de liaison pour le reste de la simulation (ligne grise dans le panneau supérieur de la figure 4c). En revanche, pour le Lys355 neutre, de multiples événements de liaison et de déliaison de différents ions oxalate ont été observés (lignes colorées dans le panneau inférieur de la figure 4c). Cela se traduit par un taux d'occupation plus élevé de 98,6 % pour le Lys355 protoné que celui de 77,0 % pour le Lys355 neutre, qui est calculé par la définition ci-dessus de l'état lié en utilisant l'oxalate et la distance du site de liaison. Ainsi, une constante de dissociation de l'oxalate plus faible est prédite pour le Lys355 protoné. Au cours des simulations de 1, 7 µs, la conformation tournée vers l'extérieur de OxlT était stable, comme le montre le graphique de la RMSD des atomes du squelette de la structure cristalline tournée vers l'extérieur (Fig. 4a). Les résultats suggèrent que la liaison de l'oxalate observée dans les simulations est un mode de liaison à un stade précoce qui devrait être suivi par le réarrangement conformationnel et la désolvatation du site de liaison et la transition vers la conformation occluse pour adapter la conformation entièrement liée.

Les simulations a – c MD ont commencé à partir de la structure cristalline OxlT sans ligand tournée vers l'extérieur (PDB ID 8HPJ). a Les RMSD de la structure cristalline initiale tournée vers l'extérieur sont indiquées pour deux trajectoires avec différents états de protonation de Lys355 dans différentes couleurs. b Instantané de l'oxalate lié à OxlT avec Lys355 protoné. Dans l'instantané de zoom arrière, les molécules d'eau à moins de 15 Å de distance de l'ion oxalate sont affichées dans la couleur CPK, tandis que celles entre 15 et 25 Å de distance sont affichées en bleu. Dans l'instantané en gros plan, les molécules d'eau à moins de 15 Å de distance de l'ion oxalate sont affichées. c Les distances des ions oxalate par rapport au site de liaison dans une seule trajectoire, soit avec Lys355 protoné (en haut), soit avec Lys355 déprotoné (en bas), sont indiquées. Les centres géométriques de l'ion oxalate et les résidus du site de liaison ont été utilisés pour calculer la distance. Différentes couleurs représentent les différents ions oxalate inclus dans la simulation. Les simulations d–f MD ont commencé à partir de la structure cristalline OxlT occluse liée à l'oxalate (PDB ID 8HPK). d Les RMSD de la structure cristalline occluse initiale sont affichées pour trois trajectoires indépendantes dans différentes couleurs. e Portes hydrophobes d'OxlT. Dans le panneau supérieur, les nombres de molécules d'eau à moins de 15, 8 et 4 Å de distance de l'ion oxalate lié sont tracés en marron, jaune et rouge, respectivement. Dans le panneau inférieur, un instantané à 1000 ns est affiché dans les vues zoom arrière et gros plan. Les molécules d'eau sont colorées comme sur le panneau b. Voir également le film supplémentaire 1. f La transition observée de la conformation occluse à la conformation tournée vers l'extérieur déclenchée par le retournement Gln34. L'ion oxalate et les résidus du site de liaison sont représentés dans la représentation en bâton. Gln34 est mis en surbrillance avec le cercle rouge. Les molécules d'eau sont représentées dans la représentation vdW. Les molécules d'eau sont colorées comme sur le panneau b. Les lignes brisées entre la chaîne latérale Thr38 et la chaîne principale Val240 en noir et rouge représentent les distances à l'intérieur ou à l'extérieur de la liaison H, respectivement. Voir aussi Film supplémentaire 2.

Nous avons ensuite abordé la dynamique conformationnelle de la conformation occluse (PDB ID 8HPK) à l'état lié à l'oxalate. Au cours de la simulation de 1 µs, deux trajectoires indépendantes sur trois sont restées à l'état occlus (Fig. 4d). Dans la conformation occluse, la plupart des molécules d'eau ont été bloquées à certaines positions des côtés périplasmique et cytoplasmique du transporteur pendant les simulations, bien que certaines soient entrées dans OxlT (Fig. 4e et Film supplémentaire 1). Une analyse de la densité de l'eau a mis en évidence des couches structurelles bloquant l'entrée d'eau dans le site de liaison de l'oxalate pendant la simulation (Fig. 9 supplémentaire). L'une d'elles est une couche hydrophobe constituée de Thr38 et Leu39 dans TM1, Val244 dans TM7 et Val261 dans TM8 du côté périplasmique (panneau inférieur gauche de la Fig. 4e). Cette couche, combinée à la liaison hydrogène entre Thr38 et Val240 dans TM7 (représentée par une ligne brisée dans le panneau inférieur gauche de la figure 4e), a également bloqué la sortie du ligand vers le côté extracellulaire et a donc servi de porte périplasmique. L'autre couche est constituée de Met128 dans TM4, Pro332 dans TM10 et Tyr348 dans TM11 du côté cytoplasmique (panneau inférieur droit de la Fig. 4e). Ces portes hydrophobes périplasmiques et cytoplasmiques, ainsi que la liaison hydrogène TM1 – ​​TM7, présentent une similitude avec le transporteur NarK rapporté précédemment42, basé sur des résidus situés à des positions similaires à celles de OxlT dans la structure alignée (Fig. 10 supplémentaire). Ce résultat suggère que les portes hydrophobes39 sont un mécanisme conservé parmi les deux transporteurs.

En revanche, dans une trajectoire à partir de la conformation occluse, une ouverture de la porte périplasmique a été observée (ligne bleue sur la Fig. 4d). Lors de la transition, le retournement de la chaîne latérale Gln34 à partir du site de liaison s'est produit en premier (Fig. 4f, Fig. 11a supplémentaire et Film supplémentaire 2). Le retournement de Gln34 a entraîné une rupture de la liaison hydrogène avec Lys355, comme observé dans la structure cristalline tournée vers l'extérieur (Fig. 3a). De plus, étant donné que Gln34 est situé un tour en amont de Thr38 dans TM1, le retournement a également provoqué une perturbation constante de la liaison hydrogène entre Thr38 et Val240, qui était liée par des fluctuations thermiques avant même le retournement (indiqué par une ligne brisée sur la figure 4f et la figure supplémentaire 11b). Après environ 280 ns après le retournement de Gln34, OxlT a commencé à s'ouvrir vers l'extérieur et de nombreuses molécules d'eau sont entrées dans le transporteur (Fig. 4f et Film supplémentaire 2). Nous notons que le flip Gln34 est une conformation transitoire et que la chaîne latérale est revenue à sa position d'origine après avoir atteint l'état orienté vers l'extérieur dans la dernière partie de la simulation, conformément à l'observation sur la structure cristalline orientée vers l'extérieur (Fig. 11a, c). Notamment, le flip Gln34 a également été observé dans une trajectoire partant de la conformation occluse avec le formiate modélisé dans le site de liaison (Fig. 12 supplémentaire). Dans cette trajectoire, la liaison hydrogène entre Thr38 et Val240 a de nouveau été complètement rompue après le basculement de Gln34, suivie d'une transition de la conformation occluse à la conformation tournée vers l'extérieur, conformément à la réaction physiologique de la libération de formiate au périplasme chez O. formigenes . En revanche, le flip Gln34 n'a été observé dans aucune des autres trajectoires non accompagnées de la transition conformationnelle dans les formes liées à l'oxalate et au formiate (Figs. 11 et 12 supplémentaires). Ces résultats suggèrent que la chaîne latérale Gln34, en conjonction avec la liaison hydrogène entre Thr38 et Val240, fonctionne comme un "verrou de la porte périplasmique" pour empêcher la transition des conformations occluses vers les conformations tournées vers l'extérieur. En effet, le mutant Q34A a présenté une perte partielle des activités de liaison et de transport par rapport à la protéine de type sauvage (Fig. 2c – e), indiquant que la mutation déstabilise la conformation occluse. Gln34, avec Thr38, est strictement conservé au sein de la famille OFA (Fig. 3 supplémentaire).

L'angle dièdre OCCO de l'ion oxalate dans le site de liaison occlus est devenu ~ 90 ° après le basculement de Gln34 (Fig. 13a supplémentaire), qui est la valeur observée en solution43. Cela contraste avec les deux autres trajectoires sans le flip Gln34, où l'angle dièdre d'oxalate est resté autour de 40–50 ° (et sa position inversée à 130–140 °; Fig. 13a supplémentaire), qui est similaire à ceux trouvés dans la structure cristalline et les calculs QM/MM. Curieusement, les valeurs observées dans l'oxalate lié à l'OxlT orienté vers l'extérieur pendant la simulation étaient largement distribuées avec des doubles pics à ~ 60 ° et ~ 120 ° (Fig. 13b supplémentaire), qui diffèrent de ceux en solution et plutôt plus proches de ceux dans la structure cristalline occluse. Ces résultats suggèrent que l'oxalate lié réorganise sa conformation en réponse au changement environnemental provoqué par la commutation conformationnelle OxlT et adopte une conformation favorable pour l'étape suivante du cycle du transporteur.

Aucune ouverture de la porte cytoplasmique n'a été observée pendant la simulation de 1 µs pour aucune des trajectoires de la conformation occluse. Cela peut être attribué aux interactions interdomaines étendues observées du côté cytoplasmique, telles que le motif A impliquant des réseaux de relais de charge (Fig. 2g) connus pour stabiliser la conformation tournée vers l'extérieur38. Ces résultats suggèrent que la transition de l'état occlus à l'état ouvert vers l'intérieur a une cinétique lente parmi l'ensemble du processus de transport. L'un des mutants énigmatiques présentant une liaison réduite à l'oxalate mais une activité de transport conservée, Y124A (Fig. 2c – e), se situe à l'entrée de la porte cytoplasmique sous l'oxalate lié (Fig. 2f et 4f). La mutation pourrait déstabiliser la couche hydrophobe à la porte et faciliter son ouverture, probablement l'étape limitante du transport, et pourrait ainsi compenser l'affinité réduite pour l'oxalate dans son activité de transport.

Les deux structures cristallines d'OxlT et les simulations MD basées sur celles-ci ont fourni des indices pour comprendre le processus de transport à accès alterné d'OxlT (Fig. 5). Le processus suivant est décrit selon le gradient électrochimique formé dans O. formigenes dans l'intestin. Pour le processus d'absorption d'oxalate, OxlT présente une vaste surface chargée positivement dans la cavité ouverte sur le périplasme, permettant une liaison de l'oxalate acide au site de liaison. La surface chargée positivement évite également la transition conformationnelle vers l'étape de transport suivante en l'absence du substrat qui est une caractéristique indispensable pour un antiporteur. Néanmoins, la liaison oxalate neutralise la charge positive locale et permet le passage conformationnel de la conformation tournée vers l'extérieur à la conformation occluse. De plus, les énergies libres de liaison relatives calculées de l'oxalate à OxlT ont révélé une stabilisation significative de la conformation occluse par rapport à la conformation ouverte vers l'extérieur (c'est-à-dire une diminution d'environ 20 kcal / mol), qui fournit une base physique pour le changement de conformation induit par l'oxalate. liaison (voir la section "Méthodes" et le tableau supplémentaire 4). L'état occlus est une étape essentielle pour que le transport serve de point de contrôle discriminatoire entre l'oxalate et les intermédiaires métaboliques nécessaires de l'hôte, tels que ceux du cycle de Krebs, en utilisant la restriction de taille imposée par la poche de liaison. La conformation occluse peut éventuellement permettre l'ouverture de la porte cytoplasmique et la libération d'oxalate dans le cytoplasme.

Le paysage conformationnel d'OxlT le ​​long des distances de porte périplasmique et cytoplasmique est illustré dans le panneau supérieur droit. Les distances Cα des résidus de grille dans les simulations MD des états occlus et ouverts vers l'extérieur et la transition induite par Gln34 sont indiquées en rouge, jaune et bleu, respectivement. Les distances grille-résidus dans les structures cristallines occluses actuelles (PDB ID 8HPK) et tournées vers l'extérieur (PDB ID 8HPJ) ainsi que la structure cristalline Nark tournée vers l'intérieur (PDB ID 4U4T) sont également indiquées.

Par la suite, un formiate se liant à l'OxlT orienté vers l'intérieur peut ramener le transporteur à l'état occlus. La transition conformationnelle requise pour revenir de l'état occlus à l'état initial orienté vers l'extérieur dans le cycle antiport peut être obtenue par un basculement transitoire d'une chaîne latérale d'un résidu voisin du substrat, Gln34, et une rupture de la liaison hydrogène entre Thr38 et Val240 . Le paysage conformationnel tracé par les distances de la porte périplasmique (Thr38-Val240) et de la porte cytoplasmique (Met128-Pro332)42,44 échantillonnées dans les simulations MD montre que les paramètres d'ordre séparent bien les conformations occluses et tournées vers l'extérieur (tracés rouges et jaunes, Fig. 5 encart). Néanmoins, la seule trajectoire qui accompagne le flip Gln34 montre une transition complète couvrant les structures cristallines occluses et tournées vers l'extérieur (points bleus sur la Fig. 5 en médaillon). Le mécanisme du changement de conformation qui peut être déclenché par un seul retournement de la chaîne latérale, ainsi que la flexibilité structurelle facilitée par le rapport élevé de glycine, expliquent probablement le renouvellement catalytique rapide présenté par OxlT12.

Ces observations structurelles impliquent que OxlT utilise l'architecture MFS et a évolué conformément à une symbiose favorable entre les animaux hôtes et les microbes intestinaux. Les caractéristiques structurelles et fonctionnelles d'OxlT sous-tendent probablement celles des autres membres de la famille OFA. Environ 2 000 membres de l'OFA sont enregistrés dans la base de données45, et tous sauf OxlT ne sont pas caractérisés sur le plan fonctionnel. Par conséquent, cette étude contribue également à comprendre les familles de protéines « sombres » inconnues. Clarifier les conformations tournées vers l'intérieur d'OxlT (un cercle pointillé sur la Fig. 5 en médaillon) est le prochain défi pour comprendre la biologie structurelle d'OxlT.

Toutes les expérimentations animales étaient conformes aux directives du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Japon et ont été approuvées par le Comité d'expérimentation animale de l'Université de Tokyo (numéro d'autorisation : RAC07101).

L'OxlT marqué au nona-His C-terminal de la souche O. formigenes OxB46 a été exprimé dans E. coli XL3 à 20 ° C pendant 24 h avec 1 mM d'isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) 47 . Les cellules bactériennes ont été mises en suspension dans un tampon de lyse (Tris-HCl 50 mM, acétate de potassium 200 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, MgCl2 5 mM, DNaseI 20 µg/mL et lysozyme 0,23 mg/mL, pH 8,0) puis rompues à l'aide EmulsiFlex C-5 (Avestin). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (9 600 x g pendant 30 min) et les membranes cellulaires ont ensuite été collectées par centrifugation (185 000 x g pendant 1 h). La fraction membranaire a été solubilisée avec 40 mM de n-dodécly-β-d-maltoside (DDM) dans du tampon A (20 mM HEPES-KOH, 200 mM d'acétate de potassium, 10 mM d'oxalate de potassium et 20 % de glycérol, pH 8,0) et appliquée sur Résine Ni-NTA Superflow (QIAGEN) ou brut HisTrap FF (GE Healthcare) dans une colonne XK16 (GE Healthcare). La colonne a été lavée avec du tampon A contenant 1 mM de DDM et 30 à 50 mM d'imidazole, puis la protéine a été éluée avec du tampon A contenant 1 mM de DDM et 250 mM d'imidazole.

Un antigène de protéoliposome a été préparé en reconstituant de l'OxlT fonctionnel purifié à haute densité dans des vésicules phospholipidiques constituées d'un mélange 10: 1 de phosphatidylcholine d'oeuf (PC) (Avanti Polar Lipids) et de lipide A adjuvant (Sigma) pour faciliter une réponse immunitaire. Des souris BALB/c (femelles âgées de 7 semaines) ont été immunisées avec l'antigène du protéoliposome en utilisant trois injections à deux semaines d'intervalle. Les souris ont été maintenues dans des conditions avec un cycle lumière/obscurité de 12 h à une température ambiante de 23 ± 3 °C et une humidité de 40 à 60 %.

Des anticorps monoclonaux de souris contre OxlT ont été sélectionnés comme décrit précédemment48. Des lignées cellulaires d'hybridome produisant des anticorps ont été générées en utilisant un protocole de fusion classique. Les clones d'hybridomes produisant des anticorps reconnaissant les épitopes conformationnels dans OxlT ont été sélectionnés par un dosage immuno-enzymatique liposome (ELISA) sur des vésicules phospholipidiques immobilisées contenant de l'OxlT purifié, permettant une sélection positive des anticorps reconnaissant la conformation native d'OxlT. Un criblage supplémentaire pour la liaison réduite d'anticorps à OxlT dénaturé par SDS a été utilisé pour une sélection négative contre des anticorps reconnaissant des épitopes linéaires. La formation d'un complexe stable entre OxlT et chaque clone d'anticorps a été vérifiée par chromatographie d'exclusion de taille par détection de fluorescence. Des molécules d'IgG entières, collectées à partir du surnageant de culture à grande échelle d'hybridomes monoclonaux et purifiées par chromatographie d'affinité sur protéine G, ont été digérées avec de la papaïne et des fragments Fab ont été isolés par filtration sur gel HiLoad 16/600 Superdex200 suivie d'une chromatographie d'affinité sur protéine A. La séquence du Fab a été déterminée via 5'-RACE standard en utilisant l'ARN total isolé à partir de cellules d'hybridome.

Des fragments de Fv à chaîne unique (scFv) contre OxlT ont été sélectionnés à partir d'une bibliothèque d'anticorps présentée par un phage de souris immunisée49. Les souris immunisées ont été euthanasiées et leur ARN de splénocyte a été isolé et converti en ADNc par PCR à transcription inverse. Le répertoire VL et VH a été assemblé via un lieur flexible de 18 acides aminés et cloné dans le vecteur de présentation de phage pComb3XSS. Des protéoliposomes biotinylés ont été préparés en reconstituant OxlT avec un mélange de PC d'œuf et de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(cap biotinyl) (16:0 biotinyl Cap-PE ; Avanti), et utilisés comme liant cibles pour la sélection scFv-phage. Les cibles ont été immobilisées sur des billes paramagnétiques revêtues de streptavidine (Dynabeads) ou des microplaques revêtues de streptavidine (Nunc). Après quatre cycles de biopanning, des ELISA de liposomes ont été réalisés sur des extraits périplasmiques de colonies individuelles. Les clones positifs ont été collectés et évalués à l'aide d'un Biacore T100 (GE Healthcare).

Les fragments scFv d'anticorps ne sont pas souhaitables pour une utilisation en tant que chaperons de cristallisation car ils peuvent former de manière intermoléculaire des dimères à permutation de domaine, et l'équilibre dimère-monomère peut augmenter l'hétérogénéité structurelle. Par conséquent, nous avons utilisé des fragments Fv pour des essais de cristallisation. Le fragment Fv a été exprimé dans Brevibacillus choshinensis en utilisant le système iRAT50. Le surnageant de culture a été ajusté à 60 % de saturation en sulfate d'ammonium et le précipité a été culotté, dissous dans du tampon TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 150 mM et NaCl) et dialysé pendant une nuit contre le même tampon. Les protéines dialysées ont été mélangées avec de la résine Ni-NTA équilibrée avec du tampon B (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM et imidazole 20 mM). Les protéines liées ont été éluées avec du tampon C (Tris-HCl 10 mM, pH 7, 5, NaCl 150 mM et imidazole 250 mM), mélangées avec TEV-His6 et dialysées pendant une nuit contre du tampon TBS. L'étiquette His6 clivée et le TEV-His6 ont été éliminés à l'aide d'une colonne HisTrap équilibrée avec du tampon B. Le fragment Fv sans étiquette a été concentré et chargé sur une colonne HiLoad16/60 Superdex75 (GE Healthcare) équilibrée avec du tampon TBS. Les fractions maximales ont été regroupées, concentrées, congelées rapidement dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C.

Pour la cristallisation de l'OxlT lié à l'oxalate complexé avec D5901Fab, l'OxlT purifié a été mélangé avec du D5901Fab purifié à un rapport molaire de 1:1,3 à 4 °C pendant une nuit et appliqué à une colonne HiLoad 16/60 Superdex200 pg (GE Healthcare) en utilisant le tampon D ( 20 mM MES-KOH, 200 mM d'acétate de potassium, 10 mM d'oxalate de potassium, 20 % de glycérol et 0,51 mM de DDM, pH 6,2) comme tampon courant. L'échantillon purifié a été dialysé dans du tampon E (MES-KOH 20 mM, oxalate de potassium 10 mM et DDM 0,51 mM, pH 6,2). Les cristaux ont été obtenus par la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise à 20 ° C en mélangeant l'échantillon purifié (~ 10 mg / ml) avec une solution réservoir de citrate de sodium 0, 1 M, pH 5, 5, NaCl 0, 05 M et 26% (v / v) PEG400. Les cristaux ont été congelés dans de l'azote liquide avant la collecte des données.

Pour la cristallisation de l'OxlT sans ligand complexé avec 20D033Fv, l'OxlT purifié a été mélangé avec du 20D033Fv purifié à un rapport molaire de 1: 2 à 4 ° C pendant la nuit et purifié à l'aide de Superdex200 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) dans le tampon F (20 mM MES -KOH, acétate de potassium 100 mM, oxalate de potassium 10 mM et DDM 0,02 %, pH 6,2). L'échantillon purifié a été reconstitué dans une mésophase lipidique. Le mélange protéine-LCP contenait 50 % (p/p) de solution de protéine, 45 % (p/p) de monooléine (Sigma) et 5 % (p/p) de cholestérol (Sigma). La mésophase lipidique résultante a été distribuée sous forme de gouttes de 50 μL dans des plaques de verre à 96 puits et recouverte de 0, 8 μL de solution de précipitation à l'aide d'un robot de cristallisation NT8-LCP (Formulatrix) et a ensuite été recouverte de fines lamelles. Les configurations de cristallisation et les plaques sandwich en verre à 96 puits (Molecular Dimension) ont été incubées à 20 ° C. Les cristaux ont été obtenus en une semaine dans les conditions de précipitation suivantes : glycine 100 mM, pH 9,0, PEG400 à 26 – 36 % (v/v) et MnCl2 à 50 – 150 mM. Les cristaux ont été récoltés directement à partir de la mésophase lipidique à l'aide de Mesh Litholoops (Protein Wave) et refroidis instantanément dans de l'azote liquide.

Les données de diffraction des rayons X pour OxlT lié à l'oxalate et pour OxlT sans ligand ont été collectées à 1,0 Å sur la ligne de lumière SPring-8 BL41XU en utilisant MX225HE (Raynoix) et BL32XU en utilisant un détecteur EIGER X 9 M (Dectris, Ltd), respectivement, sous un contrôle de BSS51 et un cryostream fonctionnant à 100 K. Les données ont été fusionnées, intégrées et mises à l'échelle à 2,6 Å (OxlT lié à l'oxalate) et 3,1 Å (OxlT sans ligand) à l'aide du système KAMO52, qui exploite BLEND53, XDS54 et XSCALE55 (Tableau supplémentaire 1). Les données ont été corrigées de l'anisotropie à l'aide du serveur STARANISO56. La correction a supprimé de nombreuses réflexions faibles avec une très faible complétude sphérique dans les coques à plus haute résolution. Pour le raffinement, nous avons utilisé des données à 3,0 Å (OxlT lié à l'oxalate) et 3,3 Å (OxlT sans ligand) qui contenaient plus de 25 % (OxlT lié à l'oxalate) et 22 % (OxlT sans ligand), respectivement, de la données dans le shell le plus élevé. La structure cristalline a été résolue par remplacement moléculaire avec PHASER57. Les modèles de recherche étaient les structures des moitiés N- et C-terminales du transporteur de glycérol-3-phosphate GlpT (PDB ID : 1PW4)58 et un fragment Fab (PDB ID : 1XF4)59 pour OxlT lié à l'oxalate, et les structures de N - et les moitiés C-terminales d'OxlT lié à l'oxalate déterminées dans cette étude (résidus 11–199 et 204–404, respectivement) et un fragment scFv (PDB ID : 5B3N)60 pour OxlT sans ligand. Les modèles de structure ont été reconstruits manuellement avec COOT61 et affinés avec Phenix62. Dans le cristal OxlT sans ligand, deux unités d'OxlT (chaînes A et D) ont été trouvées dans une unité asymétrique. Aucune différence structurelle significative n'a été observée entre les deux (Cα RMSD de 0,365 Å pour les résidus 15 à 410). La collecte de données et les statistiques de raffinement sont présentées dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Les statistiques de Ramanchandran analysées avec MolProbity63 étaient de 97,8 % favorables, 2,2 % autorisés et 0,0 % de valeurs aberrantes pour OxlT lié à l'oxalate, et 97,5 % favorisés, 2,5 % autorisés et 0,0 % de valeurs aberrantes pour OxlT sans ligand.

La liaison au ligand d'OxlT a été évaluée à l'aide du test de décalage thermique GFP (GFP-TS)35. Le vecteur d'expression de la GFPuv-fusion OxlT C-terminale a été construit précédemment23, et des mutations ont été introduites dans le vecteur via PCR en utilisant PrimeSTARMax (Takara Bio) et les amorces oligonucléotidiques répertoriées dans les données supplémentaires 1. La protéine a été exprimée en BL21(DE3) essentiellement comme décrit dans la sous-section "Préparation d'OxlT", où la production de protéines a commencé à une DO600 de 0,8 à 0,9 et induite à 20 ° C pendant 20 h.

Les cellules bactériennes exprimant la fusion GFPuv C-terminale OxlT ont été mises en suspension dans du tampon G (HEPES-KOH 20 mM, acétate de potassium 300 mM, pH 7, 0) et rompues par sonication à l'aide de UD201 (TOMY). Pour obtenir une fraction membranaire, les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (17 800 xg pendant 15 min à 4 °C), puis les surnageants ont été centrifugés à 252 000 xg pendant 30 min à 4 °C. Les fractions membranaires ont été lavées deux fois en répétant la suspension avec le tampon G suivi d'une ultracentrifugation à 252 000 xg pendant 30 min à 4 °C. Les fractions membranaires d'une culture de 20 ml ont été solubilisées avec 240 ou 480 µl de tampon G contenant 1 % (p/v) de DDM. Après une solubilisation à 4°C pendant 1 h, les insolubles ont été éliminés par ultracentrifugation 161 000 xg pendant 20 min à 4°C.

Pour les essais de mutants, les protéines OxlT-GFPuv de type sauvage et mutantes solubilisées au détergent ont été diluées avec du tampon G contenant 1% de DDM pour ajuster la concentration d'OxlT-GFPuv donnant les mêmes intensités de fluorescence. Les solutions ont ensuite été incubées pendant 1 h sur de la glace en présence ou non d'oxalate de potassium 3 mM. Pour les dosages de ligand, la solution OxlT-GFPuv de type sauvage a été incubée en présence ou en l'absence d'oxalate de sodium 10 mM, de malonate de sodium ou de succinate de sodium. Après incubation, l'octyl-β-d-glucoside dans le tampon G a été ajouté à une concentration finale de 1 %, et les solutions ont été soumises à une dénaturation thermique à 30–80 °C pendant 10 min à l'aide d'un cycleur thermique C-1000 Touch (BIO -RAD). Les fractions agrégées ont ensuite été éliminées par centrifugation des solutions à 10 740–15 340 × g (14 000 tr/min en utilisant un rotor TOMY PCR96-02, selon la position des tubes dans le rotor) pendant 20 min à 4 °C. Les surnageants résultants ont été aliquotés dans une microplaque noire à faible volume de 384 puits (Corning) et les intensités de fluorescence ont été mesurées à l'aide d'un flash Varioskan (Thermo Fisher Scientific) à une longueur d'onde d'excitation de 395 nm et une longueur d'onde d'émission de 507 nm. Les intensités de fluorescence observées ont été soustraites de celles du fond du tampon et normalisées en fixant les valeurs de l'échantillon sans dénaturation thermique à 1 et le fond à 0. Les valeurs de température de fusion apparente (Tm) ont été estimées en ajustant les valeurs d'intensité de fluorescence au Équation de Gibbs-Helmholtz64 utilisant Kaleidagraph (Hulinks), en supposant que la protéine d'intérêt est dans un équilibre entre un état de repliement et un état de dépliement et en définissant les changements d'enthalpie et de capacité thermique du dépliement (ΔH, ΔCp) et Tm comme variables indépendantes. Les données ont été analysées par une analyse de variance unilatérale bilatérale avec le test de Dunnett en utilisant le type sauvage (WT) comme référence dans Prism 8 (GraphPad). La signification statistique est définie comme *P < 0,05.

L'activité de transport d'OxlT a été évaluée en utilisant à la fois un système in cellulo avec des cellules E. coli recombinantes et un système in vitro avec des protéoliposomes reconstitués avec l'OxlT purifié. Pour les tests OxlT mutants, des mutations ont été introduites dans le vecteur d'expression OxlT, pRSF-OxlT36, via PCR en utilisant PrimeSTARMax et les amorces oligonucléotidiques répertoriées dans les données supplémentaires 1.

Dans le test in cellulo, l'activité OxlT a été mesurée par couplage avec le transfert de protons vers l'intérieur induit par la lumière par la xénorhodopsine co-exprimée dans E. coli, comme décrit précédemment36. En bref, des cellules E. coli BL21 (DE3) transformées avec les vecteurs d'expression pour OxlT et la xénorhodopsine ont été cultivées à 37 ° C, et la production de protéines a été induite par l'ajout de 1 mM d'IPTG et de 10 µM de rétinal tout-trans (Sigma) à un absorbance de 0,8 à 0,9 à 600 nm. Après une culture à 20 ° C pendant 20 h, les cellules E. coli ont été collectées par centrifugation et mises en suspension avec 50 mM de K2SO4 jusqu'à une densité cellulaire avec une DO à 660 nm d'environ 10. Le changement de pH induit par la lumière de la suspension cellulaire a été surveillé avec une électrode de pH à 25 ° C en utilisant une agitation continue. La suspension cellulaire a d'abord été placée dans l'obscurité jusqu'à ce que le pH de l'échantillon se stabilise. L'échantillon a ensuite été éclairé à l'aide d'une lampe Xe à travers un filtre Sharp Cut Y44 (un filtre passe-haut à ≥ 420 nm, HOYA) pendant 10 min, et le changement de pH en l'absence d'oxalate (ΔpH0) a été surveillé. L'intensité lumineuse a été ajustée à environ 150 mW/cm2 à 550 nm à l'aide d'un wattmètre optique et d'un capteur optique. L'échantillon éclairé a été replacé dans l'obscurité et lorsque le pH s'est stabilisé, de l'oxalate de potassium 5 mM a été ajouté à l'échantillon pour permettre le transport via OxlT pendant 10 min. L'échantillon a été à nouveau illuminé dans les mêmes conditions que ci-dessus, et le changement de pH (ApHS) a été surveillé. L'activité de transport a été évaluée par la différence de changement de pH (ΔΔpH) entre ΔpHS et ΔpH0 ; cela a été corrigé en soustrayant le changement de pH différentiel de fond (ΔΔpH) mesuré avec E. coli exprimant la xénorhodopsine seule. Les activités de chaque mutant ont été normalisées par le ΔΔpH corrigé et le niveau d'expression relatif, analysés par western-blot à l'aide de l'Anticorps Penta∙His (QIAGEN, Cat. No. 34460, dilution 1:2000), de l'OxlT sauvage mesuré sur le même jour de l'expérience (Fig. 14 supplémentaire; les taches non recadrées se trouvent dans le fichier Source Data). Nous avons également effectué un test pour le mutant Y150A ; cependant, ce mutant a affecté le niveau d'expression de la xénorhodopsine pour des raisons inconnues (Fig. 14 supplémentaire), et nous avons donc exclu le résultat Y150A de cet article.

Dans le test in vitro, les protéines WT et OxlT mutantes ont été exprimées et purifiées comme décrit ci-dessus et dans la sous-section "Préparation d'OxlT" avec des modifications mineures. Les protéines OxlT ont été éluées de la résine Ni-NTA en l'absence de glycérol dans le tampon d'élution et purifiées sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) équilibrée avec 20 mM MES-KOH, 200 mM acétate de potassium , DDM 0,2 mM, pH 6,2. Les fractions monomères ont été regroupées, concentrées à environ 1 mg/ml, additionnées de 20 % (v/v) de glycérol, quantifiées, aliquotées et congelées pour une utilisation ultérieure. Les protéoliposomes ont été préparés de manière similaire à celle décrite dans Lee et al.65. L'extrait de lipides totaux d'E. coli (Avanti, dans du chloroforme) a été aliquoté dans des tubes en verre et le solvant a été évaporé pendant plus de 5 min à température ambiante sous un courant d'azote gazeux. Afin d'obtenir des vésicules unilamellaires, des lipides d'E. coli séchés ont été remis en suspension à 6,7 mg/ml dans une solution contenant 50 mM de MOPS-KOH et 10 mM de formiate de potassium, pH 7,0, et soniqués pendant 45 secondes dans un bain-marie sonicateur. La vésicule unilamellaire a été reconstituée avec les variants OxlT purifiés à un rapport lipide:protéine de 200:1 (w/w) ou avec le volume équivalent du tampon de contrôle (50 mM MOPS-KOH avec 1,57 mM DDM, le même volume que la solution OxlT ) dans des microtubes par trois cycles de congélation-décongélation utilisant des bains d'azote liquide et d'eau. Les vésicules unilamellaires reconstituées ont été soniquées trois fois pendant 15 s au total à l'aide d'un dispositif de sonde manuelle sur de la glace pour former des (protéo)liposomes d'un diamètre <200 nm.

Les essais d'absorption d'oxalate ont été initiés en ajoutant de l'oxalate de potassium 50 mM à la solution de liposomes à 20 °C. Avant de commencer les expériences, la résine échangeuse d'anions AG1-X8 (BioRad) a été équilibrée avec un volume 1:1 (p/v) d'acétate de sodium 150 mM, pH 8,2, et préparée en centrifugeant 400 μL de suspension pendant 1 min à 700 ×g et 4 °C sur une colonne de centrifugation. Au total, 50 μL de réaction ont été collectés soit immédiatement, soit après incubation pendant le temps indiqué sur les figures. En appliquant les solutions de réaction sur les colonnes de centrifugation AG1-X8 et en centrifugeant pendant 1 min à 700 x g et 4 ° C, les ions oxalate à l'extérieur des liposomes ont été éliminés et les échantillons ont été collectés dans un microtube. Par la suite, 5 μL d'une solution à 10 % (p/v) de Triton-X100 (Nacalai tesque) ont été ajoutés à chaque échantillon pour dissoudre les liposomes contenant des ions oxalate qui ont été transportés ou adhérés au liposome. Les concentrations relatives d'oxalate ont été déterminées à l'aide du kit de dosage de l'oxalate oxydase (OxOx) (Abcam) couplé à une réaction d'oxydation utilisant l'OxOx recombinant (B. subtilis, Biovision). 10 μL de lysat de liposomes ont été mélangés avec 10 μL de tampon de détection (9 μL OxOx Assay Buffer, 0,4 μL OxOx Converter, 0,2 μL Red Probe, 0,02 μg OxOx, jusqu'à 10 μL avec de l'eau) dans chaque puits d'une plaque à 384 puits à faible volume (Corning) avec une pipette multicanaux. La plaque a été immédiatement lue par Varioskan Flash en mode cinétique fluorométrique avec une excitation à 535 nm (bande passante de 12 nm), une émission à 587 nm, un temps d'intégration de 200 msec et des intervalles de 20 sec pour un total de 83 min à température ambiante. Les pentes initiales des courbes fluorescence-temps ont été déterminées par régression linéaire sur les premières données de 600 s et interprétées comme les vitesses initiales de la réaction OxOx, qui étaient linéairement corrélées avec la concentration d'oxalate dans cette condition de dosage (Fig. 6 supplémentaire) . Au moins deux préparations de liposomes indépendantes et des essais de transport d'oxalate ont été effectués pour les variants OxlT et le contrôle négatif, et des essais OxOx ont été effectués en double ou en quadruple pour chaque condition. Le graphique à barres final affiche les valeurs normalisées à la moyenne des données WT à 60 min.

Les données (celles à 60 min dans le cas du test in vitro) ont été analysées par une analyse de variance unilatérale bilatérale avec le test de Dunnett dans Prism 8 en utilisant le WT comme référence. La signification statistique est définie comme *P < 0,05.

Les structures cristallines OxlT ont été utilisées comme structures initiales, avec des résidus manquants au niveau de la boucle centrale modélisée avec MODELLER66. Les états de protonation ont été analysés à l'aide de PROPKA 3.167,68, avec le paramètre par défaut. Sur la base de l'analyse, Lys355 présente une valeur de pKa déviée de 7,00 dans la structure tournée vers l'extérieur. Cette déviation n'a pas été observée dans la structure occluse (valeur de pKa de 8,61). Ainsi, les deux états de protonation pour Lys355 ont été considérés dans l'état orienté vers l'extérieur. La protéine OxlT a été intégrée dans la membrane à l'aide du plugin Membrane Builder dans CHARMM-GUI69,70. Une bicouche de 1-palmitoyl-2-oléoylphosphatidyléthanolamine (POPE) d'une longueur de 120 Å pour les dimensions x et y a été utilisée. Le lipide PE est un composant majeur à la fois chez O. formigenes71, dont OxlT est dérivé, et E. coli72, dans lequel des tests de transport ont été effectués. De plus, il n'y a aucune preuve que d'autres lipides spécifiques soient nécessaires pour l'activité OxlT. Le système protéine-membrane a été solvaté avec des molécules d'eau TIP3P et 150 mM de KCl, ce qui a donné une longueur de dimension z de 100 Å. Ensuite, tous les 87 Cl– ont été remplacés par 58 ions oxalate à l'aide d'AmberTools1773 sans modifier la charge totale en tenant compte de la charge effective mise à l'échelle (–1,5e) du modèle d'oxalate en solution (voir ECCR ci-dessous). Le système MD final contenait 146015 et 143611 atomes pour le système OxlT occlus et orienté vers l'extérieur, respectivement. Des simulations MD ont ensuite été effectuées à l'aide de NAMD 2.1274. Les champs de force Amber ff14SB et Lipid14 ont été utilisés pour décrire la protéine et la membrane, respectivement75,76. Le ligand oxalate en solution a été décrit avec des paramètres déterminés par la correction du continuum électronique avec remise à l'échelle (ECCR), basée sur la simulation Ab Initio Molecular Dynamic, développée par Kroutil et al.43,77. Le ligand oxalate dans le site de liaison d'OxlT a été décrit à l'aide de paramètres déterminés par le schéma Restrained Electrostatic Potential (RESP) sans appliquer la correction ECCR, considérant que l'environnement protéique diffère de celui de la solution aqueuse. Les frais de REEE ont été calculés par le logiciel Antichamber79. À notre connaissance, aucune étude n'a encore simulé l'oxalate complexé avec une protéine, bien que plusieurs études MD aient simulé la solvatation de l'anion oxalate en masse, sa complexation avec le cation calcium et le processus d'adsorption en surface80,81,82. Le système MD a été mis en place avec une minimisation pour 10 000 pas, chauffé de 0 à 10 K avec un pas de 0,1 ns par degré en ensemble NVT, puis de 10 à 310 K en NPT avec un pas de 0,2 ns par 30 degrés, et 10 ns d'équilibrage avec simulation d'ensemble NPT à 310 K. Ensuite, des cycles de production de 1, 0 et 1, 7 μs dans des conditions NPT ont été effectués pour le système OxlT occlus et orienté vers l'extérieur (pour chaque état de protonation de Lys355), respectivement. Une température de 310 K a été maintenue avec le thermostat Langevin, la pression étant réglée à 1 atmosphère à l'aide du piston Nosé-Hoover Langevin. Des conditions aux limites périodiques ont été appliquées et les interactions électrostatiques à longue portée ont été traitées par la méthode d'Ewald à mailles de particules avec une coupure de l'espace réel de 12 Å et une fonction de commutation à 10 Å. Le pas de temps d'intégration était de 2 fs.

Pour établir le système de simulation avec formiate, une fraction carboxylate de l'oxalate pointant vers le Lys355 a été remplacée par un atome d'hydrogène dans la structure occluse liée à l'oxalate pour générer la structure initiale du complexe formiate-OxlT. De plus, un ion K+ a été retiré du modèle précédent et remplacé par une molécule d'eau pour tenir compte de la perte d'une charge négative. Les paramètres de champ de force GAFF79 ont été utilisés pour le formiate. Les mêmes protocoles d'équilibrage et de production que ceux décrits ci-dessus ont été réalisés. La relaxation complète de la protéine OxlT à la fin de l'étape d'équilibrage garantit un bon ajustement du site de liaison pour un ligand plus petit ainsi qu'une conformation réaliste pour les cycles de production.

En résumé des systèmes de simulation, nous avons construit quatre systèmes avec différentes combinaisons de la structure initiale (structure ouverte vers l'extérieur ou occluse), l'état de protonation de Lys355 et le ligand lié (oxalate ou formiate ; dans le cas de la structure occluse structure). Dans le tableau supplémentaire 5, ces systèmes de simulation, ainsi que le nombre de trajectoires et le temps total de simulation, sont résumés.

L'énergie libre de liaison relative de l'oxalate à OxlT a été calculée par la méthode MM/GBSA mise en œuvre dans le programme MMPBSA.py83. Dans la méthode MM/GBSA, l'énergie libre de liaison est décomposée en énergies de phase gazeuse et de solvatation, qui sont calculées par le champ de force de la mécanique moléculaire (MM) et le modèle de solvant implicite de Born généralisé avec la surface accessible au solvant (GBSA), respectivement. Notez que l'effet d'entropie n'a pas été inclus dans le calcul. Nous avons analysé une trajectoire décrivant la transition conformationnelle de l'état occlus à l'état ouvert vers l'extérieur (Fig. 4d, f et Fig. 13a supplémentaire). La trajectoire a été divisée en trois étapes : l'OxlT occlus avec le dièdre d'oxalate ~50° (0–40 ns ; noté OxlT-occ-dih50), l'OxlT occlus avec le dièdre d'oxalate ~90° (41–320 ns ; OxlT -occ-dih90) et l'OxlT ouvert vers l'extérieur avec le dièdre d'oxalate ~ 90 ° (321–1000 ns; OxlT-op-dih90). L'énergie libre de liaison MM/GBSA a été déterminée pour chaque étape de la trajectoire (voir le tableau supplémentaire 4).

La densité de l'eau pendant la simulation a été calculée par un module de MDAnalysis84 après que la protéine ait été centrée et superposée.

Plusieurs modèles QM/MM ont été utilisés avec la structure liée à l'oxalate (PDB ID 8HPK) pour évaluer la pertinence de l'environnement du site de liaison pour la conformation interne de l'oxalate. Tout d'abord, le ligand oxalate a été affecté à la partie QM tandis que la protéine entière a été affectée à la partie MM. Deuxièmement, la première coquille de résidus qui interagissent directement avec le ligand (Gln34, Tyr35, Tyr124, Arg272 et Lys355) a été ajoutée à la partie QM. Troisièmement, la deuxième coquille du site de liaison (Tyr150, Trp324, Tyr328 et Trp352) a été ajoutée à la partie QM pour créer un environnement de site de liaison complet entourant le ligand oxalate. Tous les calculs QM/MM ont été effectués avec ONIOM85, implémenté en Gaussian 1686. La méthode de la théorie fonctionnelle de la densité (DFT)87,88 a été utilisée pour traiter la région QM au niveau B3LYP/6-31 + G(d,p) de la théorie89 ,90, incluant la correction de dispersion de Grimme avec amortissement de Becke−Johnson (D3BJ)91. La région MM du système a été décrite par le même champ de force que celui des simulations MD. Le schéma d'intégration électronique a été utilisé de telle sorte que la région MM polarise la densité électronique QM. Un atome de liaison explicite a été ajouté entre les carbones α et β pour chaque résidu situé dans la région QM afin de gérer la frontière covalente entre les parties QM et MM. Les minima de la surface d'énergie potentielle ont été confirmés par l'absence de fréquences imaginaires. Un calcul DFT pur supplémentaire du ligand oxalate avec des chaînes latérales fixes des résidus du site de liaison a été effectué avec le même niveau de théorie QM que dans les calculs QM / MM. Comme pour les calculs QM/MM, les structures optimisées, obtenues sous forme de points stationnaires sur la surface d'énergie potentielle, étaient de véritables minima énergétiques sans fréquences imaginaires.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées et les facteurs de structure d'OxlT ont été déposés dans la Protein Data Bank sous les numéros d'accession 8HPK (complexe OxlT-fab ; forme occluse liée à l'oxalate)92 et 8HPJ (complexe OxlT-Fv ; forme tournée vers l'extérieur sans ligand)93. Les données relatives au MD ont été déposées dans le référentiel Zenodo [https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686]94. Les coordonnées avec les identifiants PDB 1PW458, 1XF459, 5B3N60, 4U4W95, 4U4T96 et les séquences d'acides aminés de la famille OFA (IPR026355) ont été utilisées dans cette étude. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions les Drs. Kazuya Hasegawa, Hideo Okumura, Yoshiaki Kawano et Kunio Hirata, SPring-8, pour le support de collecte de données de diffraction des rayons X ; Yayoi Nomura, Yoshiko Nakada-Nakura et Yumi Sato pour leur assistance technique dans la génération d'anticorps ; Kyoko Fujita pour leur assistance technique avec les essais fonctionnels ; et le professeur Keietsu Abe pour leurs précieux conseils sur les tests fonctionnels OxlT. Les expériences de rayonnement synchrotron ont été réalisées aux BL41XU et BL32XU de SPring-8 et, avec les approbations du Japan Synchrotron Radiation Research Institute (JASRI) (Proposition n° 2012B1096, 2015A1080, 2015B2080). Les calculs ont été partiellement effectués à l'aide du Research Center for Computational Science, Okazaki, Japon (Projet : 21-IMS-C175, 22-IMS-C189). Ce travail a été soutenu financièrement par JSPS KAKENHI Grant Numbers JP20H03195 (à AY), JP18H02415 (à KO), JP26440086 (à TH) et Research Fund de la Koyanagi Foundation (à AY), Takeda Science Foundation (à Ta.S.), le Projet de plateforme pour soutenir la découverte de médicaments et la recherche en sciences de la vie [Bases pour soutenir la découverte de médicaments innovants et la recherche en sciences de la vie (BINDS)] de l'AMED sous le numéro de subvention. JP20am0101079 (à SI). Les auteurs tiennent à remercier Enago (www.enago.jp) pour la révision en anglais.

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Titouan Jaunet-Lahary & Kei-ichi Okazaki

École supérieure de médecine, Université de Kyoto, Kyoto, 606-8501, Japon

Tatsuro Shimamura, Norimichi Nomura, Kouta Hirasawa & So Iwata

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Masahiro Hayashi, Naotaka Tsutsumi, Keiichi Kojima, Yuki Sudo & Atsuko Yamashita

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École des sciences pharmaceutiques, Université d'Okayama, Okayama, 700-8530, Japon

Naotaka Tsutsumi, Yuta Suehiro & Atsuko Yamashita

École supérieure des sciences de l'environnement et de la vie, Université d'Okayama, Okayama, 700-8530, Japon

Takashi Tamura

Centre de recherche pour les sciences et technologies avancées, Université de Tokyo, Tokyo, 153-8904, Japon

Hiroko Iwanari et Takao Hamakubo

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Te.H. et AY a conçu l'étude. Te.S., MY, Ta.S., KH et NN ont effectué la purification des protéines. NN, HI, Ta.H. et SI ont effectué la préparation d'anticorps. Te.S., MY, AY, Te.H., Ta.S. et KH ont effectué la cristallisation et la collecte de données aux rayons X. Ta.S., Te.H., MH et AY ont effectué l'analyse de la structure. MH, NT, Yut.S., KK, AY et Yuk.S. effectué les tests fonctionnels. TJL et KO ont effectué des simulations de dynamique moléculaire et de QM/MM. TT a effectué une simulation préliminaire de dynamique moléculaire. AY, KO, Ta.S., NN, TJL, MH, NT et Yut.S. a rédigé l'article, avec la contribution de tous les autres auteurs.

Correspondance à Tatsuro Shimamura, Kei-ichi Okazaki, Teruhisa Hirai ou Atsuko Yamashita.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Lan Guan et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Jaunet-Lahary, T., Shimamura, T., Hayashi, M. et al. Structure et mécanisme du transporteur d'oxalate OxlT dans une bactérie dégradant l'oxalate dans le microbiote intestinal. Nat Commun 14, 1730 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

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Reçu : 01 novembre 2021

Accepté : 20 février 2023

Publié: 03 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

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