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Oct 23, 2023

Un modèle de miniporc humanisé pour le test toxicologique d'anticorps recombinants thérapeutiques

Nature Génie biomédical

Nature Biomedical Engineering volume 6, pages 1248–1256 (2022)Citer cet article

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L'innocuité de la plupart des protéines recombinantes humaines peut être évaluée chez des souris transgéniques tolérantes à des protéines humaines spécifiques. Cependant, en raison d'une diversité génétique insuffisante et de différences fondamentales dans les mécanismes immunitaires, les modèles de maladies humaines chez les petits animaux sont souvent inadaptés aux tests d'immunogénicité et à la prédiction des effets indésirables chez les patients humains. La plupart des anticorps thérapeutiques humains déclenchent des réponses xénogéniques chez les animaux de type sauvage et donc une clairance rapide des médicaments, ce qui rend difficiles les tests toxicologiques in vivo des anticorps humains. Nous rapportons ici la génération de mini-porcs de Göttingen portant un mini-répertoire de gènes humains pour les chaînes lourdes d'immunoglobuline γ1 et γ4 et la chaîne légère d'immunoglobuline κ. Conformément aux observations chez des patients humains, les miniporcs génétiquement modifiés ont toléré les anticorps monoclonaux cliniquement non immunogènes de l'isotype IgG1κ daratumumab et bevacizumab, et ont induit des anticorps contre l'inhibiteur de point de contrôle atezolizumab et l'amunaleukine interleukine cergutuzumab. Les miniporcs humanisés peuvent faciliter les tests d'innocuité et d'efficacité des anticorps thérapeutiques.

L'efficacité et l'innocuité des anticorps monoclonaux (mAbs) peuvent être compromises si l'administration d'un composé provoque une réponse immunitaire chez l'homme, qui se manifeste par le développement d'anticorps anti-médicament (ADA). Plusieurs facteurs peuvent induire des ADA et sont classés comme liés au patient, à la maladie, au produit ou au traitement. Ils peuvent entraîner des symptômes légers à potentiellement mortels qui sont bien documentés pour plusieurs protéines thérapeutiques cliniquement approuvées1. Ces effets indésirables varient d'un composé à l'autre et sont difficiles à prévoir. Il existe encore des lacunes importantes dans la compréhension de la pharmacocinétique des ADA, de leur capacité neutralisante et de leur réactivité croisée avec des molécules endogènes ou d'autres composés biologiques.

Pour pallier ces inconvénients, plusieurs modèles précliniques in silico et in vitro différents ont été développés2,3,4,5,6,7. L'évaluation de l'immunogénicité dans des modèles in vivo comprend des essais sur des animaux dans le contexte d'un système immunitaire intact. Cependant, toute protéine humaine provoquera probablement une réponse immunitaire chez un animal d'essai en raison des différences entre les espèces. Ceci peut être contourné en utilisant des anticorps de substitution spécifiques de l'espèce animale (mais leur valeur prédictive peut être remise en question) ou des animaux transgéniques qui expriment la protéine humaine et la reconnaissent donc comme « soi ». Toute réponse immunitaire déclenchée sera donc due à l'état altéré de la protéine recombinante. Pour éviter la génération de lignées animales transgéniques séparées pour des protéines thérapeutiques individuelles, quelques groupes de recherche, dont le nôtre, ont généré des souris transgéniques exprimant des ensembles de gènes d'immunoglobuline humaine8,9,10. Contrairement à la plupart des modèles de souris humanisées par anticorps (Ab) pour la découverte d'Ab, nos animaux transgéniques expriment toujours leurs gènes endogènes d'immunoglobuline (Ig) et sont donc totalement immunocompétents. La fonction des transgènes d'Ig humaine est uniquement d'induire une tolérance et ils n'ont pas nécessairement besoin d'être impliqués dans une réponse immunitaire. Par conséquent, les lignées de souris que nous avons établies portent un mini-répertoire d'IgG1 humaines composé uniquement de la forme sécrétée des chaînes lourdes d'Ig-γ1 humaines, ainsi que des chaînes légères d'Ig-κ et d'Ig-λ. Les gènes inclus sont ceux les plus couramment utilisés chez l'homme ainsi que dans la production d'anticorps thérapeutiques11. Ces souris transgéniques permettent des études d'immunogénicité pour toute une catégorie d'anticorps thérapeutiques humains et l'évaluation de modifications potentiellement immunogènes dans des préparations d'Ac10. Cependant, pour des raisons anatomiques et de durée de vie évidentes, les données obtenues chez la souris ne sont pas toujours directement transposables à l'homme en termes de voies d'application, de pharmacocinétique et d'évaluations toxicologiques à long terme12. Le Conseil international pour l'harmonisation (ICH) des exigences techniques pour l'enregistrement des produits pharmaceutiques à usage humain exige des tests de sécurité précliniques sur une espèce de rongeurs et une espèce de non-rongeurs. Dans le cas des anticorps thérapeutiques, les primates non humains (PNH) sont souvent la seule option. La disponibilité d'un modèle universel non-rongeur et non-PSN pour l'évaluation des propriétés immunogènes et immunotoxiques possibles des Abs recombinants humains serait un outil précieux. Cela améliorerait la sécurité préclinique pour ce marché en croissance rapide.

Le porc présente de nombreux avantages pour les études précliniques, étant similaire à l'homme en taille, dans l'anatomie de nombreux systèmes d'organes et dans ses réponses physiologiques et physiopathologiques. Les porcs ont un temps de gestation relativement court, une grande taille de portée, une maturation rapide et une facilité de logement dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes. Fait important, les similitudes immunologiques avec les humains font du porc un modèle idéal pour la recherche préclinique13,14,15. Comme pour les souris, les méthodes de génie génétique sont maintenant bien établies pour les porcs.

Sur la base des résultats antérieurs chez la souris10, des mini-porcs transgéniques de Göttingen portant un répertoire similaire de gènes humains des chaînes Ig lourdes (IGH) et Ig κ légères (IGK) ont été générés. Les grandes lignes du projet sont présentées sur la Fig. 1a. Deux vecteurs d'expression ont été générés. La première construction comprend des segments de gène IGH de lignée germinale non réarrangés codant pour 5 éléments variables (V), 5 éléments de diversité (D) et 6 éléments de jonction (J) en combinaison avec la séquence requise pour conduire la production de chaînes H sécrétoires d'IgG1 (hIgG1) humaines. Pour évaluer si non seulement hIgG1 mais aussi l'isotype hIgG4 peuvent être exprimés, la région constante γ4 (Cγ4) et les séquences de commutation correspondantes (Sμ, Iγ-Sγ) ont également été incluses dans cette construction (Fig. 1b, IGH-γ1-γ4 ; Numéro d'accès NCBI : OL809665). Les IgG1 et hIgG4 humaines ont été choisies car ce sont les deux isotypes d'Ig les plus couramment utilisés dans les mAb thérapeutiques humains16. La construction IGH-γ1-γ4 devrait permettre le passage de l'isotype Ig de Cγ1 à Cγ4. La deuxième construction contient des segments de gène IGK codant pour les éléments 2V et 5J plus la séquence codant pour la région constante κ (C) (Fig. 1c, IGK ; numéro d'accès NCBI : OL809666). Lors d'un réarrangement approprié, ces éléments géniques devraient générer un répertoire de protéines IgG humaines solubles sans interférer avec le processus de réarrangement et de formation du répertoire des protéines Ig porcines endogènes, car cela nécessite l'expression de l'Ig humaine liée à la membrane, qui n'est pas incluse dans le construction transgénique (voir Fig. 1b). Tous les gènes V utilisés dans les constructions ont été choisis sur la base de leur utilisation prédominante dans le sang périphérique humain11 et se sont avérés dans le modèle de souris transgénique fournir une large tolérance aux IgG1 Abs10 humaines.

a, Un aperçu du projet montrant la génération et l'application de mini-porcs transgéniques IgG humains. b, la forme sécrétée de la chaîne lourde d'immunoglobuline (IGH-γ1-γ4) et c, la chaîne légère κ (IGK). Figure créée avec BioRender.com.

Des fibroblastes rénaux isolés de porcs nains mâles de Göttingen ont été co-transfectés avec les vecteurs d'expression IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) et IGK (10,9 kb) et un gène marqueur sélectionnable (blasticidine pilotée par la phosphoglycérate kinase (PGK), BS; 1,05 kb) . Des clones unicellulaires ont été isolés et criblés par PCR pour la présence des trois transgènes. Quatre à cinq clones cellulaires ont été regroupés et utilisés pour le transfert nucléaire de cellules somatiques, ce qui a donné naissance à huit porcelets mâles Göttingen nés vivants. Tous étaient positifs pour la présence des trois transgènes (non représentés). Quatre animaux fondateurs ont atteint la maturité sexuelle (TG1–TG4). Tous les quatre portaient 2 copies du transgène humain IGH-γ1-γ4 et IGK tel que déterminé par PCR en gouttelettes, mais diffèrent par le nombre de copies du gène marqueur sélectionnable (TG1 – TG3, 1 copie; TG4, 3 copies). À l'exception de TG4, tous les animaux fondateurs exprimaient la chaîne lourde (HC) et légère (LC) de l'IgG humaine (Fig. 2). Par conséquent, seuls TG1–TG3 ont été utilisés pour une reproduction ultérieure. Tous les descendants (F1 – F3) présentaient un héritage de transgènes mendéliens, indiquant une insertion à un seul locus génomique, et le fondateur et la progéniture présentaient des niveaux similaires d'IgG humaine dans le sérum (Fig. 2a, b) et un phénotype reproductible (Fig. 3 et 4) . Contrairement aux souris transgéniques IgG1 humaines10, aucune molécule d'IgG1 hybride (humain/porc) n'a été détectée chez les miniporcs transgéniques. Un ELISA sandwich à double anticorps capturant l'Igκ LC humaine et détectant l'Ig HC humaine a démontré l'expression d'IgG entièrement humaines (Extended Data Fig. 1).

a, Western blot montrant l'expression des protéines IgG lourdes γ1 (IgH-γ1) et κ légères (IgL-κ) dans le sérum isolé des miniporcs IgG fondateurs transgéniques (TG1 – -TG3) et des animaux F1 des lignées TG2 et TG3. Les miniporcs WT Göttingen étaient négatifs pour la présence des deux protéines. La protéine IgG humaine et le PBS ont été utilisés comme contrôle positif et négatif, respectivement. Les images non traitées de tous les Western blots sont présentées dans les données supplémentaires 1. b, La présence de la protéine IgG1 humaine a été confirmée par analyse ELISA dans le sérum isolé de miniporcs F1 représentant les 3 lignées (TG ligne 1, n = 5; TG ligne 2, n = 4 ; ligne TG 3, n = 3). Aucune IgG1 humaine n'a été détectée chez les animaux WT (n = 4). La barre horizontale représente la médiane. Chaque point de données représente une réplique biologique. c, les gènes des chaînes lourdes et légères de l'IgG humaine subissent des réarrangements fonctionnels des gènes. Une sélection de réarrangements des quatre VH et des deux transgènes Vk est représentée. Les réarrangements des gènes humains VH et VΚ montrent des additions de N nucléotides. La séquence IgG4 humaine des variants de commutation d'isotype est représentée en marron. Les éléments J dans les gènes V réarrangés sont donnés entre parenthèses, les éléments du gène D identifiés sont soulignés et indiqués à droite.

Données source

a, les miniporcs transgéniques IgG humains (n ​​= 2) montent des réponses d'anticorps anti-KLH IgG porcines à des niveaux comparables à ceux des animaux WT (n = 2) lors d'une immunisation unique avec KLH dans un adjuvant d'alun. b, les miniporcs transgéniques IgG humains (n ​​= 2) peuvent monter des réponses de mémoire après rechallenge avec KLH au jour 35 (flèche). La ligne rouge pointillée indique un seuil arbitraire à un titre de 200. Analyse statistique par analyse de variance à 2 voies (ANOVA) ; NS, non significatif. La barre horizontale représente la médiane. Chaque point de données représente une réplique biologique.

Données source

a, Présentation schématique de la stratégie d'immunisation sans adjuvant. Des échantillons de sang pour l'analyse ADA sont prélevés avant chaque traitement. b, titre d'anticorps IgG porcin anti-bevacizumab après immunisation de 6 mini-porcs fondateurs transgéniques hIgG (TG) et de 6 contrôles WT avec le bevacizumab. Données résumées de 3 études individuelles, chacune avec 2 miniporcs transgéniques et 2 WT. c, Titre en anticorps IgG porcin anti-bevacizumab après immunisation de 4 mini-porcs transgéniques hIgG de la génération F1 et de 4 animaux WT avec le bevacizumab. d, DO des anticorps IgG porcins anti-daratumumab mesurés par ELISA chez des miniporcs (TG, n = 4 ; WT, n = 4) immunisés avec le daratumumab. La ligne rouge pointillée indique un seuil arbitraire à un titre de 200 ou moyenne + seuil 6×sd en cas de DO. Analyse statistique par ANOVA à 2 facteurs. La barre horizontale représente la médiane. Chaque point de données représente une réplique biologique.

Données source

Pour caractériser le réarrangement des segments du gène V humain dans les lymphocytes B porcins, des échantillons d'ARN messager (ARNm) ont été isolés du sang périphérique d'un miniporc transgénique. L'analyse de la séquence a confirmé les réarrangements V(D)J fonctionnels des segments de gènes humains variables lourds (VH) et kappa légers (VK) ainsi que les additions de N-nucléotides pour les chaînes lourde et légère. Ce dernier indique un réarrangement temporellement coordonné des gènes des chaînes lourdes et légères humaines au cours du fonctionnement de la désoxynucléotidyl transférase terminale porcine (TdT) responsable de l'addition de N-nucléotides à la jonction des immunoglobulines réarrangées. Cela a également été observé dans le modèle de souris analogue10. De plus, la séquence VH humaine contenait des échanges d'acides aminés (voir Fig. 1 supplémentaire) dus à des mutations somatiques en dehors des régions déterminant la complémentarité (Fig. 2c). Toutes les tentatives de détection de la protéine IgG4 dans le sérum de mini-porcs transgéniques hIgG ont échoué. Cependant, l'analyse du séquençage de l'ARN a révélé une petite proportion de gènes IgG4 commutés (0, 76%; Fig. 2c et Fig. 1 supplémentaire). Bien que cela prouve qu'une commutation d'isotype IgG se produit, il s'agit d'un événement rare et explique pourquoi aucune protéine IgG4 humaine n'a été détectée. Tout cela indique que les protéines porcines et humaines sont compatibles et que le réarrangement des gènes d'IgG humaines se déroule efficacement chez les miniporcs transgéniques.

Les animaux hIgG sont en bonne santé et ne souffrent pas d'une charge d'infection accrue. L'autopsie des animaux a montré un aspect normal de la rate, des ganglions lymphatiques et de la moelle osseuse (données non présentées).

La compétence immunitaire a également été confirmée expérimentalement à l'aide de l'hémocyanine de patelle (KLH)16, antigène modèle dépendant des lymphocytes T, dont la réponse est bien documentée pour les miniporcs de Göttingen17. Deux hIgG et deux mini-porcs de type sauvage (WT) ont reçu une injection sous-cutanée (sc) d'une dose unique de 20 mg kg-1 de poids corporel KLH dans un adjuvant à l'alun et la réponse des anticorps spécifiques à KLH a été suivie pendant 35 jours. Les quatre miniporcs ont monté une réponse IgM (non illustrée) et IgG 1 semaine après l'immunisation, confirmant que l'expression du transgène n'altère pas les réponses Ab dépendantes des lymphocytes T à cette protéine (Fig. 3a). Dans une expérience de rappel subséquente, la première dose de KLH a été suivie d'une nouvelle provocation des animaux avec une deuxième dose au jour 35. L'augmentation rapide des titres d'IgG porcines spécifiques de KLH après l'immunisation de rappel démontre que les mini-porcs humanisés sont également capables de monter un réponse de la mémoire (Fig. 3b). Comme prévu, aucune IgG humaine spécifique de KLH n'a été détectée (données non présentées). Ainsi, comme observé précédemment pour les souris transgéniques hIgG110, l'expression d'IgG humaines ne compromet pas la capacité immunitaire des miniporcs de Göttingen.

Ensuite, nous avons évalué l'état de tolérance des mini-porcs humanisés au bevacizumab et au daratumumab Abs thérapeutiques humains prototypes. Les deux sont des anticorps classiques de l'isotype IgG1 humain avec de faibles taux d'immunogénicité (inférieurs à 1 %) chez les patients1.

Des mini-porcs humains transgéniques et de type sauvage IgG ont reçu des injections répétées de bevacizumab (0, 4 mg kg -1 de poids corporel, 7 injections; Fig. 4a). Des échantillons de sérum hebdomadaires ont été prélevés et l'ADA IgG porcin a été mesuré par ELISA. Le traitement au bevacizumab a entraîné la formation d'ADA chez les mini-porcs de type sauvage, mais pas chez les mini-porcs fondateurs exprimant hIgG (Fig. 4b) ou leur progéniture F1 (Fig. 4c), démontrant une tolérance immunitaire envers les IgG1 humaines et confirmant l'hérédité des traits.

Le traitement par daratumumab n'a pas entraîné d'augmentation substantielle des titres d'ADA, que ce soit chez les animaux transgéniques ou de type sauvage. Cependant, les données brutes ont révélé une augmentation tardive faible mais appréciable des signaux ADA chez les animaux de type sauvage non trouvés dans le groupe de miniporcs transgéniques (Fig. 4d).

Tous les résultats sont conformes à nos résultats précédents de souris transgéniques IgG, où les deux Abs se sont également avérés non immunogènes, tandis que les souris de type sauvage ont montré une réponse ADA forte (bevacizumab) ou modérée (daratumumab)10 (tableau supplémentaire 1).

Pour déterminer le potentiel de ce modèle pour évaluer l'immunogénicité des anticorps humains thérapeutiques, des cohortes de quatre miniporcs hIgG et WT ont été traitées avec 0,4 mg kg-1 de poids corporel d'atezolizumab ou de cergutuzumab. Ceux-ci sont connus pour induire des réponses ADA chez 39 % et 70 % des patients, respectivement18,19. Tous les mini-porcs ont développé des réponses ADA. Il n'y avait pas de différence significative dans le titre d'ADA entre les mini-porcs transgéniques humains IgG et leurs compagnons de portée de type sauvage après traitement avec le cergutuzumab amunaleukine (Fig. 5a). En revanche, le titre d'ADA était significativement plus faible pour les miniporcs humanisés après traitement par l'atezolizumab (P = 0,0075) (Fig. 5b), reflétant la différence d'immunogénicité entre ces deux anticorps thérapeutiques. Les résultats chez les mini-porcs transgéniques IgG humains récapitulent ceux observés chez l'homme et les données d'études chez les souris transgéniques hIgG120.

a, Anticorps IgG porcins anti-cergutuzumab amunaleukine après immunisation (porcs miniatures TG, n = 4 ; porcs minis WT, n = 4) avec l'amunaleukine cergutuzumab. b, Anticorps IgG porcins anti-atezolizumab après immunisation avec l'atezolizumab. La ligne rouge pointillée indique un seuil arbitraire à un titre de 200. Analyse statistique par ANOVA à 2 voies. La barre horizontale représente la médiane. Chaque point de données représente une réplique biologique.

Données source

Pour assurer la prévisibilité des études pharmacologiques, l'ICH recommande l'utilisation de modèles animaux pertinents. Cependant, des études toxicologiques, pharmacocinétiques et pharmacodynamiques prolongées avec des protéines recombinantes comprenant des anticorps thérapeutiques sont entravées par la réponse immunitaire de l'animal contre les protéines étrangères. Pour les surmonter, au cours des dernières décennies, la plupart des protéines recombinantes humaines ont été évaluées chez des souris transgéniques tolérantes à la protéine humaine spécifique21 et dans le cas des anticorps, dans des modèles murins tolérants aux IgG8,9,10. Cependant, plusieurs facteurs ont limité leur application pour l'évaluation de l'immunogénicité. Ceux-ci incluent le manque de diversité génétique et les différences fondamentales dans les mécanismes immunitaires entre les souches de souris consanguines22,23. De plus, la taille des souris limite leur utilisation pour l'étude de l'immunogénicité via certaines voies d'application, comme le dosage intravitréen. En raison de la similitude de l'anatomie, de la physiologie et de la biochimie porcines et humaines, les porcs ont été suggérés comme modèle non rongeur approprié pour les tests de sécurité précliniques. La plupart des protéines, y compris celles du système immunitaire, partagent des similitudes structurelles et fonctionnelles avec leurs homologues humains. Par rapport aux souris, le système immunitaire des porcs ressemble plus à celui des humains24 et ils sont moins consanguins que les souches de souris. Plusieurs lignées de porcs miniatures (Hanford, Yucatan, Yucatan micro, Sinclair et Göttingen) ont été développées et sont couramment utilisées pour l'évaluation préclinique de la sécurité25. Les miniporcs de Göttingen ont un bagage génétique et des paramètres physiologiques bien définis (paramètres d'hématologie et de chimie clinique, hémodynamique), ce qui en fait un animal modèle idéal. Cependant, il faut mentionner que les porcs nécessitent des coûts plus élevés par rapport aux modèles de rongeurs car davantage de réactifs expérimentaux, de soins aux animaux et d'élevage sont nécessaires. Néanmoins, la taille et l'anatomie/physiologie des porcs permettent des études pharmacocinétiques et des voies d'administration plus pertinentes, telles que l'injection intravitréenne et l'inhalation, difficiles à réaliser chez la souris.

Nous avons décrit un modèle de miniporc Göttingen génétiquement modifié pour une utilisation dans des études précliniques avec des anticorps humains recombinants. En introduisant un mini-répertoire de gènes humains IgG1 et IgG4 dans la lignée germinale porcine, nous avons généré des mini-porcs qui sont tolérants à la plupart, mais pas à tous, des anticorps recombinants humains.

Nous avons montré le réarrangement réussi des gènes germinaux humains IGH-γ1-γ4 et IGK et la production de protéines IgG humaines sériques. L'incorporation de séquences de commutation humaines (Sμ, Ig-Sγ1) dans la construction transgénique a entraîné l'expression d'ARNm d'IgG4, indiquant un traitement approprié par la machinerie de commutation porcine. Les miniporcs transgéniques ont transmis les nouveaux traits de manière stable à leur progéniture. Bien qu'exprimée à de faibles niveaux, la quantité de protéine IgG humaine était suffisante pour induire et préserver la tolérance immunologique aux Ac IgG1 humains.

Nous avons montré une tolérance immunologique aux anticorps humains en utilisant quatre anticorps thérapeutiques qui suscitent (atezolizumab, cergutuzumab amunaleukin) ou manquent (daratumumab, bevacizumab) d'immunogénicité clinique. Comme prévu, l'atezolizumab et l'amunaleukine de cergutuzumab ont induit, contrairement au bevacizumab et au daratumumab, l'ADA chez les miniporcs transgéniques hIgG. La réponse immunitaire contre le bevacizumab était forte chez les mini-porcs de type sauvage mais faible après traitement avec le daratumumab. Le daratumumab est une immunothérapie approuvée pour le myélome multiple qui épuise les cellules cancéreuses exprimant CD3826. Nous ne pouvons pas exclure la liaison résiduelle du daratumumab au CD38 porcin et la déplétion subséquente des plasmocytes sécrétant de l'ADA, ce qui peut expliquer la faible réponse immunitaire. Bien que nous ayons montré une tolérance à une variété/nombre d'anticorps IgG1 humains, d'autres expériences sont nécessaires pour évaluer la tolérance à une gamme beaucoup plus large d'anticorps humains.

La raison de la formation d'ADA en réponse aux anticorps atezolizumab et cergutuzumab amunaleukine est supposée être liée à leur mode d'action. Le variant interleukine-2 (IL-2) du cergutuzumab amunaleukine réagit de manière croisée avec le récepteur IL-2 de l'homme et du porc (sur la base de l'homologie de séquence et des données expérimentales27), qui est connu pour jouer un rôle important dans l'immunité et la tolérance28 . L'atezolizumab forme un contact étroit avec le ligand de mort programmé humain 1 (PD-L1) via 16 résidus d'acides aminés clés29, qui sont hautement conservés chez les humains, les souris et les porcs. Sur la base de la structure cristalline du complexe PD-L1/atezolizumab humain29, nous avons généré un modèle structurel in silico d'interaction PD-L1/atezolizumab murin et porcin qui suggère des propriétés de liaison plus fortes pour le complexe porcin par rapport à celui des souris (Supplémentaire figure 2). Sur la base de ces données et du fait que l'interaction de l'atezolizumab avec le PD-L1 murin a été confirmée expérimentalement30, une réactivité croisée similaire avec le PD-L1 porcin peut être supposée. Le mécanisme d'immunogénicité pourrait donc être associé à l'inhibition de l'interaction PD1/PD-L1, un régulateur important de l'auto-tolérance31.

Il est bien connu que la pharmacologie des anticorps thérapeutiques lors de la liaison à leurs cibles est un facteur majeur de toxicité et influence le profil d'immunogénicité32,33. Par conséquent, un manque de réactivité croisée limiterait l'utilité des modèles animaux transgéniques hIgG. Comme les données actuelles montrent une grande similitude de séquence entre la plupart des antigènes humains et porcins, cela ne devrait pas poser de problème34,35,36 mais devrait être pris en compte pour chaque nouvel anticorps testé.

La sensibilité avec laquelle les miniporcs transgéniques hIgG répondent aux composés immunogènes tout en tolérant les Abs non immunogènes en fait un modèle idéal pour les évaluations de sécurité des anticorps thérapeutiques et la prédiction des effets secondaires possibles.

L'ICH demande que des tests de sécurité précliniques soient effectués dans des modèles animaux prédictifs - une espèce de rongeurs et une espèce de non-rongeurs. Les lignées de souris précédemment générées et les miniporcs humanisés nouvellement dérivés répondent à ces exigences pour les anticorps recombinants humains et pourraient donc permettre des tests d'innocuité et d'efficacité et réduire le besoin d'études sur les PSN.

L'autorisation pour la génération de porcs transgéniques et la conduite des expérimentations animales a été délivrée par le gouvernement de Haute-Bavière, Allemagne (ROB-55.2-1-54-2532-6-13). Les expériences ont été réalisées conformément à la loi allemande sur la protection sociale et à la norme de l'Union européenne pour le soin et l'utilisation des animaux d'expérimentation.

Deux constructions d'ADN recombinant codant pour la forme soluble de la chaîne lourde γ d'Ig humaine (IGH) et de la chaîne légère d'Ig κ (IGK) ont été générées comme décrit précédemment10. La construction IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) comprend une région de 10,9 kb contenant cinq régions variables (VH 1-69, VH 4-59, VH 3-30, VH 3-23, VH 1-18), cinq régions de diversité (DH3-3, DH 4-4, DH2-8, DH3-9, DH3-10), un fragment de 8,5 kb portant les éléments de jonction JH-1 à JH-6, une région d'enhancer et de commutateur intronique (Sμ), et une Fragment de 9,1 kb contenant les constantes γ-1 (exons 1–4) et γ-4 (exons 1–4) codant pour les isoformes IgG1 et IgG4 sécrétées. Toutes les régions étaient flanquées de séquences endogènes du gène IGH humain entre 400 pb et 1,3 kb de longueur. La construction IGK (10,9 kb) comprend un fragment de 1,5 kb contenant deux régions variables (Vκ 3-20 et Vκ 1-17), un fragment de 5,6 kb contenant cinq éléments de jonction Jκ-1 à Jκ-5, une région C et une souris Élément activateur Igκ 3' (E). Tous les fragments étaient flanqués de séquences endogènes du gène IGK humain entre 500 pb et 1,7 kb de longueur.

Des fibroblastes de rein porcin (PKF) ont été isolés à partir d'un mini-porc mâle de Göttingen par la méthode standard37. Les PKF ont été cultivés avec du DMEM à haute teneur en glucose additionné de 10% de FBS (sérum bovin fœtal), de NEAA 2 mM (acides aminés non essentiels) et de l-glutamine 2 mM. Les cellules ont été passées tous les 3 à 5 jours et maintenues à 50 à 90 % de confluence dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Tous les produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich.

1 à 2 PKF passés ont été électroporés (Eporator, Eppendorf) avec les vecteurs d'expression IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) et IGK (10,9 kb) et un gène marqueur sélectionnable (blasticidine pilotée par PGK, BS; 1,05 kb) à une concentration de 13 μg, 4,5 μg et 0,05 μg, respectivement (rapport molaire de 10:10:1). Les trois transgènes ont été préparés pour la transfection en éliminant le squelette plasmidique. Les constructions IGK et IGH-γ1-γ4 ont été purifiées par électrophorèse préparative en champ pulsé et électroélution, et la cassette d'expression BS par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le kit Wizard (Sigma-Aldrich). Pour la transfection, les cellules ont été soumises à une impulsion électrique de 1 200 V pendant 85 μs, suivie d'une incubation à température ambiante pendant 5 min. 48 h après la transfection, les cellules ont été sélectionnées avec 8 μg ml-1 BS. Des clones cellulaires transfectés stables individuels ont été isolés, des échantillons de chaque clone ont été cryoconservés à un stade précoce et des échantillons répliqués ont été cultivés pour d'autres analyses.

L'ADN isolé à partir de clones cellulaires transfectés stables individuels a été utilisé pour le criblage par PCR. Les amorces suivantes ont été utilisées pour identifier la présence du transgène IGH-γ1-γ4 : IGH_F et IGH_R pour amplifier le fragment de 1,4 kb, transgène IGK : IGK_F et IGK_R pour amplifier le fragment de 1,26 kb. Pour le transgène BS : les amorces BS_F et BS_R ont été utilisées pour amplifier le fragment de 0,5 kb. Les séquences d'amorces sont données dans le tableau supplémentaire 2. La PCR a été réalisée à l'aide de la polymérase GoTaq. Les paramètres de cycle thermique étaient : 5 min, 95 °C ; puis 35 cycles de : 15 s, 95 °C ; 30 s, 60 °C ; 1 minute, 72 °C ; suivi de 5 min, 72 °C.

Le transfert nucléaire a été effectué comme décrit précédemment38. En bref, des ovocytes mûris in vitro ont été énucléés et une seule cellule donneuse a été placée dans l'espace périvitellin de chaque ovocyte. Après la fusion et l'activation des embryons, les embryons reconstitués ont été transférés dans l'oviducte de cochettes réceptrices synchronisées sur le plan hormonal. Entre 80 et 120 embryons reconstruits ont été transférés à chaque cochette receveuse.

La ddPCR a été réalisée comme décrit précédemment39. Le nombre de copies du transgène a été déterminé à l'aide de sondes marquées par fluorescence : IGH 5'FAM-ATGGGCACGACCGACCTGAGC-BHQ3' (amorces : dIGH_F et dhIGH_R) ; IGK 5'FAM-AGGGCTTCACAGATAGAGCTCATTTT-BHQ3' (amorces : dIGK_F et dIGK_R). La sonde GAPDH 5′HEX-TGTGATCAAGTCTGGTGCCC-BHQ3′ (dGAPDH_F et ddGAPDH_R) a été utilisée comme référence. Les séquences d'amorces sont données dans le tableau supplémentaire 2. Les gènes cibles ont été quantifiés en utilisant le système QX100 (BioRad Laboratories).

Le sang d'un miniporc transgénique IgG humain mâle âgé d'un an (F3) a été recueilli dans des tubes K2EDTA, puis mélangé avec de l'ARNlater et stocké à -80 ° C. L'ARN du sang a été extrait à l'aide du kit de purification d'ARN sanguin RiboPure (Invitrogen). L'indice d'intégrité de l'ARN (RIN) était > 9, tel que déterminé par le bioanalyseur Agilent 2100. L'ARN a été transcrit à l'aide du SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen) avec 500 ng d'ARN total en entrée. Par la suite, les transcrits d'IgG humaines recombinées ont été amplifiés par PCR à l'aide d'un kit Q5 High-Fidelity PCR (NEB). Tout d'abord, sept amorces sens spécifiques à différents segments variables de chaînes légères lourdes et variables kappa ont été utilisées en combinaison avec des amorces antisens se liant à des séquences communes de chaînes lourdes constantes lourdes et légères kappa. Ensuite, les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification QIAquick PCR (Qiagen). Les produits de PCR des réactions de chaîne lourde ont été utilisés comme matrice pour la PCR nichée avec un autre ensemble de cinq paires d'amorces. Toutes les séquences d'amorces sont données dans le tableau supplémentaire 2. Par la suite, des bibliothèques de séquençage Illumina ont été préparées à partir de 10 pM de chaque produit de PCR purifié à l'aide du protocole de préparation d'échantillons d'ADN TruSeq Nano (Illumina). Les bibliothèques d'échantillons ont été séquencées sur une analyse Illumina MiSeq en utilisant un séquençage apparié pendant 2 × 300 cycles.

Les deux compagnons de lectures appariées se chevauchant ont été fusionnés à l'aide de la version 0.667_i86linux32 de l'outil usearch et des paramètres -fastq_pctid 75 et -fastq_maxdiffs 2540. Par la suite, les lectures ont été traduites en séquences d'acides aminés dans le cadre anticipé et filtrées pour la présence de 5 acides aminés adjacents attendus. acides et l'absence de codons stop pour obtenir des réarrangements potentiellement fonctionnels. La Fig. 1a supplémentaire représente les nombres de lecture obtenus.

Les Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen) ont été lavées et recouvertes soit de 4 μg d'IgG1 anti-humaine de souris biotinylée (clone HP6069, Invitrogen) soit de 5 μg d'Ig κ anti-humaine de souris biotinylée (clone G20-193, BD) par échantillon selon la norme protocoles. Pour l'immunoprécipitation, les billes enrobées ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C sur un rotateur avec 100 ul de sérum de miniporc dilué 1: 2 dans du PBS. Après les étapes de lavage suivantes, les anticorps IgG1 ou Ig κ humains précipités ont été élués en chauffant à 95 ° C pendant 10 min avec un tampon d'échantillon Laemmli 2x (BioRad) et chargés directement sur des gels mini-PROTEAN TGX (4–20%, BioRad) . Le sérum de miniporc de type sauvage dopé avec 100 ng d'anticorps IgG1κ humain a servi de contrôle positif et SeeBlue Plus2 (Invitrogen) associé à MagicMark XP (Invitrogen) a servi de marqueur de poids moléculaire. Après séparation par électrophorèse, les échantillons ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose (iBlot, Invitrogen). Après blocage avec du lait écrémé en poudre à 5 % dans une solution saline tamponnée au tris-Tween (TBST), les membranes ont été sondées avec 1:5 000 peroxydase de raifort (HRP) chèvre anti-humain IgG H+L (polyclonal, Jackson) ou 1:10 000 HRP souris anti-humain Ig κ (clone EPR5367-8, Abcam) et développé à l'aide du substrat SuperSignal West Femto (Thermo Fisher).41,42

Pour la quantification des IgG humaines, des plaques ELISA Nunc MaxiSorp (Invitrogen) ont été coatées avec 1 μg ml-1 d'IgG anti-humain H+L de lapin (polyclonal, OriGene) dans un tampon de couchage (bicarbonate de sodium 0,1 M pH 9,6, Alfa) à 4 °C pendant la nuit. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS contenant 0,05% de Tween-20 avant blocage avec du PBS contenant 2% de BSA (Thermo Fisher) pendant 1h. Des dilutions en série d'échantillons de sérum de miniporc ou d'IgG1k humaine purifiée comme contrôle positif ont été préparées dans du PBS + 1% de FBS et incubées sur les plaques ELISA lavées pendant 2,5 h à température ambiante. Après un lavage ultérieur, l'IgG humaine liée a été sondée pendant 1 h à température ambiante à l'aide d'IgG anti-humain HRP (clone G18-145, BD), lavée puis développée à l'aide du substrat Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher). La réaction a été arrêtée après 5 min en utilisant de l'acide sulfurique 0,18 M (Merck Millipore) et la densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm en utilisant le lecteur de plaque VersaMax ELISA. Les valeurs de DO de quatre courbes standard ont été interpolées pour calculer la concentration d'IgG1 humaine dans le sérum.

Pour détecter la présence de protéines IgG entièrement humaines ou hybrides porcines/humaines, un test ELISA a été réalisé comme décrit ci-dessus avec les anticorps suivants : (1) revêtement avec un Ac spécifique de chèvre F(ab')2 anti-chaîne légère κ humaine (LC) ( polyclonal, Sigma-Aldrich) et détection avec un Ac anti-chaîne lourde d'IgG humaine (HC) marqué à la HRP (clone G18-145, BD) (pour la reconnaissance d'IgG humaine); et (2) revêtement avec un anticorps spécifique anti-humain Ig κ LC de souris (clone G20-361, BD) et détection avec un anti-porc IgG HC de souris marqué HRP (clone 1G5H7, ProSci) (pour la reconnaissance des IgG porcines/humaines ).

Des mini-porcs transgéniques IgG humains et des mini-porcs WT Göttingen des deux sexes ont été immunisés côte à côte avec sept injections sous-cutanées deux fois par semaine de l'antigène dilué dans du PBS. Les antigènes ont été administrés aux doses suivantes : KLH 20 mg kg-1 ; bevacizumab, daratumumab, cergutuzumab amunaleukine et atezolizumab 0,4 mg kg−1 de poids corporel.

Des échantillons de sang ont été prélevés au jour 0 (naïf) et à intervalles hebdomadaires pendant 4 à 5 semaines avant les injections. Le sang a été recueilli dans des tubes de sérum Z-Gel (Sarstedt), laissé coaguler à température ambiante pendant 30 min suivi d'une centrifugation.

Pour la détection de l'ADA, des plaques ELISA ont été recouvertes de 5 μg ml-1 de l'antigène qui a été utilisé pour l'immunisation ou de fragments de celui-ci comme décrit ci-dessus. Des échantillons de sérum dilués en série (1:50, puis 1:3 pour un total de 8 dilutions) ont été incubés pendant 2 h à température ambiante et la liaison de l'ADA a été détectée par 1 h d'incubation avec l'IgG de chèvre anti-porc AffiniPure couplée à la phosphatase alcaline ( H+L) (polyclonal, Jackson) anticorps de détection. Par la suite, les plaques ELISA ont été développées pendant 10 min avec du p-nitrophényl phosphate (Merck Millipore) avant de lire la DO à 405 nm.

Pour le calcul des titres ADA IgG, une valeur seuil a été déterminée pour chaque étude sur la base de la DO moyenne à la dilution 1:50 de tous les échantillons naïfs multipliée par leur écart type multiplié par 6. Les valeurs aberrantes de base ont été déterminées comme étant au-delà de 1,5 × l'intervalle interquartile du quartile 3, et exclues. Les valeurs de DO des échantillons de sérum titrés ont été ajustées à l'aide du polynôme du 5ème degré et les titres ont été déterminés par l'intersection de cette courbe avec le seuil déterminé. Tous les titres supérieurs au seuil arbitraire de 200 sont déterminés comme positifs.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Les données sources des figures sont fournies avec ce document. Les ensembles de données brutes et analysées générées au cours de l'étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. Les données sources sont fournies avec ce document.

Dingman, R. & Balu-Iyer, SV Immunogénicité des protéines pharmaceutiques. J.Pharm. Sci. 108, 1637–1654 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Baker, MP, Reynolds, HM, Lumicisi, B. & Bryson, CJ Immunogénicité des protéines thérapeutiques : principales causes, conséquences et défis. Soi Non Soi 1, 314–322 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson, R. & Jiskoot, W. Modèles d'évaluation du potentiel immunogène relatif des particules de protéines dans les formulations de protéines biopharmaceutiques. J.Pharm. Sci. 101, 3586–3592 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Brinks, V. et al. Modèles précliniques utilisés pour la prédiction de l'immunogénicité des protéines thérapeutiques. Pharm. Rés. 30, 1719-1728 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jawa, V. et al. Immunogénicité dépendante des lymphocytes T des protéines thérapeutiques : évaluation préclinique et atténuation. Clin. Immunol. 149, 534-555 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wullner, D. et al. Considérations pour l'optimisation et la validation d'un test in vitro de lymphocytes T dérivés de PBMC pour la prédiction de l'immunogénicité des produits biothérapeutiques. Clin. Immunol. 137, 5–14 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Brearley, C., Jaber, A., Bertolino, M., Priestley, A. & Seiberling, M. Évaluation de l'innocuité, de la tolérabilité et des propriétés PK / PD de deux nouvelles formulations d'IFN-beta1a administrées par voie sous-cutanée: un double comparaison en aveugle contrôlée par placebo avec la formulation actuellement disponible. Int. J.Clin. Pharmacol. Là. 45, 307–318 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Filipe, V. et al. Immunogénicité de différentes formulations d'anticorps monoclonaux IgG stressés chez des souris transgéniques immunotolérantes. AcM 4, 740–752 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bi, V. et al. Développement d'un modèle de souris tolérante aux anticorps humains pour évaluer le risque d'immunogénicité dû aux biothérapies agrégées. J.Pharm. Sci. 102, 3545–3555 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bessa, J. et al. L'immunogénicité des agrégats d'anticorps dans un nouveau modèle de souris transgénique. Pharm. Rés. 32, 2344-2359 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Brezinschek, HP et al. Analyse du répertoire des gènes VH humains. Effets différentiels de la sélection et de l'hypermutation somatique sur les lymphocytes B périphériques humains CD5(+)/IgM+ et CD5(-)/IgM+. J.Clin. Investir. 99, 2488-2501 (1997).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Melo, EO, Canavessi, AM, Franco, MM & Rumpf, R. Transgenèse animale : état de l'art et applications. J. Appl. Genet. 48, 47–61 (2007).

Article PubMed Google Scholar

Flisikowska, T., Kind, A. & Schnieke, A. Porcs génétiquement modifiés pour modéliser les maladies humaines. J. Appl. Genet. 55, 53–64 (2014).

Article PubMed Google Scholar

Flisikowska, T., Kind, A. & Schnieke, A. Porcs comme modèles de cancers humains. Thériogénologie 86, 433–437 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kalla, D., Kind, A. & Schnieke, A. Porcs génétiquement modifiés pour étudier le cancer. Int. J. Mol. Sci. 21, 488 (2020).

Article CAS PubMed Central Google Scholar

Swaminathan, A., Lucas, RM, Cher, K. & McMichael, AJ Hémocyanine de patelle - un antigène modèle pour les études immunotoxicologiques humaines. Br. J.Clin. Pharmacol. 78, 1135-1142 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peachee, VL, Smith, MJ, Beck, MJ, Stump, DG & White, KL Jr. Caractérisation de la réponse anticorps T-dépendante (TDAR) à l'hémocyanine de patelle (KLH) chez le cochon miniature de Gottingen. J. Immunotoxicol. 11, 376–382 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

van Brummelen, EMJ et al. Immunocytokine variant de l'IL-2 ciblée par le CEA marquée au 89Zr chez les patients atteints de tumeurs solides : accumulation tumorale médiée par le CEA et rôle de la liaison au récepteur de l'IL-2. Oncocible 9, 24737–24749 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Davda, J. et al. Immunogénicité des thérapeutiques oncologiques immunomodulatrices à base d'anticorps. J. Immunother. Cancer 7, 105 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bray-French, K. et al. Gérer l'impact de l'immunogénicité à l'ère de l'immunothérapie : du laboratoire au chevet du patient. J.Pharm. Sci. 110, 2575-2584 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jiskoot, W. et al. Modèles de souris pour évaluer l'immunogénicité des protéines : leçons et défis. J.Pharm. Sci. 105, 1567-1575 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trunova, GV et al. Caractéristique morphofonctionnelle du système immunitaire chez les souris BALB/c et C57BL/6. Taureau. Exp. Biol. Méd. 151, 99-102 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dawson, H. Dans The Minipig in Biomedical Research, 1ère édition (eds Dayan, AD et al.) Une évaluation comparative des génomes du porc, de la souris et de l'homme : analyse structurelle et fonctionnelle des gènes impliqués dans l'immunité et l'inflammation. (CRC Press, 2011).

Swindle, MM, Makin, A., Herron, AJ, Clubb, FJ Jr. & Frazier, KS Swine comme modèles dans la recherche biomédicale et les tests toxicologiques. Vétérinaire. Pathol. 49, 344–356 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Swindle, MM Le développement de modèles porcins dans la découverte et le développement de médicaments. Future Med. Chim. 4, 1771–1772 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Offidani, M. et al. Daratumumab pour la prise en charge du myélome multiple nouvellement diagnostiqué et en rechute/réfractaire : traitements actuels et émergents. Devant. Oncol. 10, 624661 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Collins, RA, Tayton, HK, Gelder, KI, Britton, P. & Oldham, G. Clonage et expression de l'interleukine-2 bovine et porcine dans le baculovirus et analyse de la réactivité croisée des espèces. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 40, 313-324 (1994).

Article CAS PubMed Google Scholar

Malek, TR & Castro, I. Signalisation des récepteurs de l'interleukine-2 : à l'interface entre la tolérance et l'immunité. Immunité 33, 153-165 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, F. et al. Base structurelle de l'atezolizumab, un anticorps thérapeutique anti-PD-L1. Oncocible 8, 90215–90224 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lesniak, WG et al. Détection de PD-L1 dans les tumeurs en utilisant [(64)Cu]Atezolizumab avec PET. Bioconjug. Chim. 27, 2103-2110 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keir, ME et al. L'expression tissulaire de PD-L1 médie la tolérance des lymphocytes T périphériques. J. Exp. Méd. 203, 883–895 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brennan, FR et al. Évaluation de l'innocuité et de l'immunotoxicité des anticorps monoclonaux immunomodulateurs. MAbs 2, 233–255 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kroenke, MA, Milton, MN, Kumar, S., Bame, E. & White, JT Évaluation des risques d'immunogénicité pour les thérapeutiques multispécifiques. AAPS J. 23, 115 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sopp, P., Redknap, L. & Howard, C. Réactivité croisée des anticorps monoclonaux de l'antigène de différenciation des leucocytes humains sur des cellules porcines. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 60, 403–408 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Saalmuller, A. et al. Résumé de la section des homologues animaux de HLDA8. Cellule. Immunol. 236, 51-58 (2005).

Article PubMed Google Scholar

Faldyna, M. et al. Anticorps monoclonaux anti-humains à réaction croisée comme outil d'identification des lymphocytes B chez le chien et le porc. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 119, 56–62 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Richter, A. et al. Potentiel des cellules rénales primaires pour la transgenèse par transfert nucléaire de cellules somatiques chez le porc. BMC Biotechnol. 12, 84 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kurome, M., Kessler, B., Wuensch, A., Nagashima, H. & Wolf, E. Transfert nucléaire et transgenèse chez le porc. Méthodes Mol. Biol. 1222, 37-59 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rieblinger, B. et al. Forte fonction xénoprotectrice par des transgènes à copie unique placés séquentiellement à un locus permissif. Xénotransplantation 25, e12382 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Edgar, RC Recherche et regroupement d'ordres de grandeur plus rapides que BLAST. Bioinformatique 26, 2460–2461 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Irani, Y., Scotney, P., Nash, A. & Williams, KA Réactivité croisée des espèces d'anticorps utilisés pour traiter les affections ophtalmiques. Investir. Ophtalmol. Vis. Sci. 57, 586-591 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kaempf, S. et al. Effets du bevacizumab (Avastin) sur les cellules rétiniennes en culture organotypique. Investir. Ophtalmol. Vis. Sci. 49, 3164–3171 (2008).

Article PubMed Google Scholar

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Nous remercions L. Petersen et R. Moser pour le soutien expérimental, G. Steiner pour les calculs de titre, et C. Klein et S. Klostermann pour une contribution utile concernant la réactivité croisée des anticorps. De plus, nous remercions PJ Knuckles, A. Kiialainen et U. Nelböck-Hochstetter pour l'initiation du séquençage VDJ, et A. Greiter-Wilke et EM Amen pour le soutien vétérinaire et organisationnel continu. Ce travail a été financé par F. Hoffmann-La Roche Ltd.

Les auteurs suivants ont contribué à parts égales : Tatiana Flisikowska, Jerome Egli, Angelika Schnieke et Antonio Iglesias.

Département des sciences moléculaires de la vie, Chaire de biotechnologie de l'élevage, École des sciences de la vie Weihenstephan, Université technique de München, Freising, Allemagne

Tatiana Flisikowska, Krzysztof Flisikowski, Marlene Stumbaum & Angelika Schnieke

Roche Pharmaceutical Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, Bâle, Suisse

Jérôme Egli, Erich Küng, Martin Ebeling, Roland Schmucki, Thomas Singer, Felix Weber & Antonio Iglesias

Roche Pharmaceutical Research and Early Development, Roche Innovation Center Munich, Penzberg, Allemagne

Guy-Georges

Centre génétique et Département des sciences vétérinaires, Élevage moléculaire des animaux et biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Allemagne

Mayuko Kurome, Barbara Kessler, Valeri Zakhartchenko et Eckhard Wolf

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AI, TS, AS et TF ont contribué à la conception et à la conception de l'étude. JE, TF, AI et AS ont rédigé l'article. TF, KF, MS, MK, BK, VZ, EW, JE et EK ont réalisé les expériences. JE, TF, AS, AI, FW, ME, RS et GG ont analysé et interprété les données. Tous les auteurs ont fourni des commentaires actifs et précieux sur le manuscrit.

Correspondance à Felix Weber ou Angelika Schnieke.

JE, EK, ME, RS, GG, TS, FW et AI sont des employés de F. Hoffmann-La Roche SA. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biomedical Engineering remercie John Hammond, Bernd Jilma et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Un test ELISA sandwich à double anticorps a été réalisé avec du sérum isolé de mini-porcs transgéniques F0 (n = 4), F1 (n = 4) et F2 (n = 4). Le sérum humain (Sigma-Aldrich) (1:100 dilué) et le sérum de type sauvage (WT, n = 10) ont servi d'échantillons de contrôle. a, La présence de protéine IgG1 entièrement humaine (revêtement : Ac spécifique de la chaîne légère κ (LC) anti-humaine de chèvre, détection : Ac anti-chaîne lourde de l'IgG humaine (HC) marqué HRP) dans le sérum isolé de miniporcs transgéniques b, ELISA pour détecter les IgG hybrides porcines/humaines (revêtement : souris anti-humain Ig κ LC Ac spécifique, détection : souris anti-porc IgG HC) a montré une certaine réactivité croisée avec la LC porcine conduisant à un signal positif chez les miniporcs WT et TG. Cependant, une détection avec des souris IgG anti-porc HC n'a pas augmenté de manière significative le signal chez les miniporcs transgéniques indiquant l'expression de protéines IgG entièrement humaines. L'analyse statistique a été effectuée par une analyse de variance unidirectionnelle ordinaire (ANOVA) et le test de comparaisons multiples de Holm-Sidak ; p = valeur P, ns = non significatif, les barres d'erreur représentent l'écart type. Chaque point de données représente une réplique biologique.

Données source

Figures et tableaux supplémentaires.

Western blots non recadrés pour la figure 2a.

Données sources pour les Fig. 2a et 3–5, et pour les données étendues Fig. 1.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Flisikowska, T., Egli, J., Flisikowski, K. et al. Un modèle de miniporc humanisé pour les tests toxicologiques d'anticorps recombinants thérapeutiques. Nat. Biomédical. Eng 6, 1248–1256 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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Reçu : 15 juillet 2021

Accepté : 01 juillet 2022

Publié: 22 septembre 2022

Date d'émission : novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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