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Sep 06, 2023

Conception de novo de biocapteurs de protéines modulaires et accordables

Nature tome 591, pages

Nature volume 591, pages 482–487 (2021)Citer cet article

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Les commutateurs protéiques naturels ont été réutilisés pour le développement de biocapteurs et de rapporteurs pour des applications cellulaires et cliniques1. Cependant, le nombre de ces commutateurs est limité et leur réingénierie est un défi. Ici, nous montrons qu'une classe générale de biocapteurs à base de protéines peut être créée en inversant le flux d'informations via des commutateurs protéiques conçus de novo dans lesquels la liaison d'une clé peptidique déclenche des sorties biologiques d'intérêt2. Les capteurs conçus sont des dispositifs moléculaires modulaires avec un état sombre fermé et un état luminescent ouvert ; la liaison de l'analyte entraîne le passage de l'état fermé à l'état ouvert. Étant donné que le capteur est basé sur le couplage thermodynamique de la liaison de l'analyte à l'activation du capteur, un seul domaine de liaison cible est requis, ce qui simplifie la conception du capteur et permet une lecture directe en solution. Nous créons des biocapteurs capables de détecter avec sensibilité la protéine anti-apoptose BCL-2, le domaine IgG1 Fc, le récepteur HER2 et la neurotoxine botulique B, ainsi que des biocapteurs pour la troponine cardiaque I et un anticorps anti-virus de l'hépatite B avec la haute sensibilité nécessaires à la détection clinique de ces molécules. Étant donné le besoin d'outils de diagnostic pour suivre le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)3, nous avons utilisé l'approche pour concevoir des capteurs pour la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 et des anticorps contre les protéines de la membrane et de la nucléocapside. Le premier, qui incorpore un liant4 de domaine de liaison au récepteur de pointe (RBD) conçu de novo, a une limite de détection de 15 pM et un signal de luminescence 50 fois plus élevé que le niveau de fond. La modularité et la sensibilité de la plate-forme devraient permettre la construction rapide de capteurs pour une large gamme d'analytes, et mettent en évidence la puissance de la conception de protéines de novo pour créer des systèmes de protéines multi-états avec des fonctions nouvelles et utiles.

Les biocapteurs à base de protéines jouent un rôle important dans la biologie synthétique et les applications cliniques, mais la conception des biocapteurs s'est jusqu'à présent principalement limitée à la réingénierie des protéines naturelles1. Trouver des domaines spécifiques de liaison à l'analyte qui subissent des changements de conformation lors de la liaison est difficile, et même lorsqu'ils sont disponibles, des efforts considérables d'ingénierie des protéines sont généralement nécessaires pour les coupler efficacement à un domaine rapporteur5,6. Il est donc souhaitable de construire des plates-formes de biocapteurs modulaires qui peuvent être facilement réutilisées pour détecter différentes cibles protéiques d'intérêt. Des systèmes modulaires ont été développés pour détecter les anticorps7,8,9 et les petites molécules10,11, mais les capteurs de protéines généraux représentent un plus grand défi compte tenu de la grande diversité des structures, des tailles et des états d'oligomérisation des protéines, et des approches telles que les plateformes de protéines semi-synthétiques12,13,14 , ou les commutateurs de calmoduline15,16, nécessitent généralement un dépistage considérable pour trouver des candidats potentiels en raison d'une prévisibilité limitée17.

Un biocapteur de protéines peut être construit à partir d'un système avec deux états presque isoénergétiques, dont l'équilibre est modulé par l'analyte détecté. Les propriétés souhaitables dans un tel capteur sont : (i) le changement de conformation déclenché par un analyte doit être indépendant des détails de l'analyte, de sorte que le même système global peut être utilisé pour détecter de nombreuses cibles différentes ; (ii) le système doit être accordable de manière à ce que des analytes avec différentes énergies de liaison et différentes concentrations typiques puissent être détectés sur une large plage dynamique ; et (iii) le changement conformationnel doit être couplé à une sortie sensible. Nous avons émis l'hypothèse que ces attributs pourraient être atteints en inversant le flux d'informations dans des commutateurs protéiques conçus de novo dans lesquels la liaison à une protéine cible d'intérêt est contrôlée par la présence d'un actionneur peptidique2. Nous avons développé un système composé de deux composants protéiques : premièrement, un « lucCage » qui comprend un domaine cage et un domaine de verrouillage qui contient un motif de liaison à la cible et un fragment de luciférase divisé (petit BiT (SmBiT) 114)18 ; et deuxièmement, une «lucKey» qui contient un peptide clé qui se lie à l'état ouvert de lucCage et au fragment complémentaire de luciférase fractionné (grand BiT (LgBit) 11S) 18 (Fig. 1a). lucCage a deux états : un état fermé, dans lequel le domaine cage se lie au verrou et empêche stériquement le motif de liaison de se lier à la cible et SmBiT de se combiner avec LgBit pour reconstituer l'activité de la luciférase, et un état ouvert, dans lequel ces interactions de liaison sont non bloqué et lucKey peut se lier au domaine de la cage. L'association de lucKey avec lucCage entraîne la reconstitution de l'activité luciférase (Fig. 1a, à droite). La thermodynamique du système est réglée de telle sorte que l'énergie libre de liaison de lucKey à lucCage (ΔGCK) est insuffisante pour surmonter le coût d'énergie libre de l'ouverture de lucCage (ΔGopen) en l'absence de cible (ΔGopen − ΔGCK >> 0), mais en la présence de la cible, l'énergie libre de liaison supplémentaire du verrou à la cible (ΔGLT) entraîne l'ouverture du verrou et la reconstitution de la luciférase (ΔGopen - ΔGCK - ΔGLT << 0) (Fig. 1b, c). Ce système satisfait aux propriétés (i) et (ii) ci-dessus, car une large gamme d'activités de liaison peut être mise en cage, et parce que le commutateur est contrôlé thermodynamiquement, les énergies de liaison lucKey et cible peuvent être ajustées pour obtenir l'activation aux concentrations cibles pertinentes. Parce que lucKey et lucCage sont toujours les mêmes, le système est modulaire - la même association moléculaire peut être couplée à la liaison de nombreuses cibles différentes. La bioluminescence fournit une lecture rapide et sensible de l'association lucCage-lucKey basée sur l'analyte, satisfaisant la propriété (iii).

a, mécanisme schématique du capteur. La forme fermée de lucCage (à gauche) ne peut pas se lier à lucKey, empêchant ainsi le fragment SmBiT de luciférase fractionné d'interagir avec LgBit. La forme ouverte (à droite) peut se lier à la fois à la cible et à la clé, permettant la reconstitution de SmBiT et LgBiT pour l'activité luciférase. b, Thermodynamique de l'activation des biocapteurs. Le coût en énergie gratuite (ΔGopen) du passage de cage fermée (espèce 1) à cage ouverte (espèce 2) défavorise l'association clé (espèce 5) et reconstitution de l'activité luciférase (espèce 6) en l'absence de cible. En présence de la cible, les énergies libres combinées de la liaison à la cible (2→3 ; ΔGLT), de la liaison à la clé (3→4 ; ΔGCK) et de l'association SmBiT-LgBiT (4→7 ; ΔGR) surmontent le ΔGopen défavorable, entraînant l'ouverture du lucCage et la reconstitution de l'activité luciférase. c, Thermodynamique de la conception des biocapteurs. Les paramètres concevables sont ΔGopen et ΔGCK ; ΔGR est le même pour toutes les cibles et ΔGLT est pré-spécifié pour chaque cible. Pour une détection d'analyte sensible mais à faible bruit de fond, ΔGopen et ΔGCK doivent être réglés de telle sorte que l'état fermé (espèce 1) soit sensiblement plus faible en énergie libre que l'état ouvert (espèce 6) en l'absence de cible, mais plus élevé en énergie libre que le état ouvert en présence de cible (espèce 7).

Les états de ce système de biocapteur sont en équilibre thermodynamique, les paramètres accordables ΔGopen et ΔGCK régissant les populations des espèces possibles, ainsi que l'énergie libre d'association de l'analyte au domaine de liaison ΔGLT (Fig. 1b). Nous avons simulé la dépendance du système de capteurs sur ΔGopen (données étendues Fig. 1a), ΔGLT (données étendues Fig. 1b) et la concentration de l'analyte et des composants du capteur (données étendues Fig. 1c, d). La sensibilité de la détection de l'analyte est fonction de ΔGLT, avec une limite inférieure d'environ un dixième de la constante de dissociation (Kd) pour la liaison de l'analyte (Extended Data Fig. 1b). Au-dessus de cette limite inférieure, la variation de la concentration de lucCage et de lucKey permet au système de répondre à différentes plages de concentration cible (Extended Data Fig. 1c, d). La sensibilité peut être davantage modulée en ajustant la force de l'interaction cage-verrou intramoléculaire et de l'interaction cage-clé intermoléculaire (ΔGopen et ΔGCK, respectivement); par exemple, une interaction cage-verrou trop étroite entraîne un signal faible en présence de cible, et une interaction trop faible entraîne un signal de fond élevé en l'absence de cible (données étendues Fig. 1a, e). Notre stratégie de conception vise à trouver cet équilibre en modulant ΔGopen et ΔGCK en faisant varier la longueur de l'hélice du loquet (et de la clé) et en introduisant des interactions polaires enterrées favorables ou défavorables aux interfaces cage-loquet ou cage-clé2 (Extended Data Fig. 1f, g).

Pour concevoir des capteurs basés sur ces principes, nous avons développé une méthode basée sur Rosetta 'GraftSwitchMover' pour identifier les emplacements des peptides de liaison à la cible dans le verrou de sorte que la protéine résultante soit stable à l'état fermé et que les interactions avec la cible soient bloquées (Méthodes supplémentaires ). Comme premier test, nous avons greffé le peptide SmBiT et le peptide BIM à l'état fermé du switch LOCKR asymétrique optimisé décrit précédemment (Extended Data Fig. 2). SmBiT adopte une conformation de brin β dans l'holoenzyme luciférase, mais nous avons supposé qu'il pourrait adopter une structure secondaire hélicoïdale dans le contexte de l'échafaudage de faisceau hélicoïdal, car la structure secondaire peut dépendre du contexte19. Nous avons échantillonné différents emplacements pour les deux séquences peptidiques à travers le verrou, sélectionné les solutions d'énergie la plus faible (données étendues Fig. 2a) et exprimé 12 conceptions dans Escherichia coli. Nous avons mélangé les conceptions avec lucKey dans un rapport 1: 1, puis ajouté BCL-2, qui se lie au BIM avec une affinité nanomolaire20, et observé une augmentation rapide de la luminescence (Extended Data Fig. 2b, f; nous nous référons au meilleur de ces comme 'lucCageBIM'), qui démontre que l'actuateur LOCKR2 actionné en sens inverse peut fonctionner comme un biocapteur. La plage de détection de l'analyte pourrait être ajustée en faisant varier la concentration du capteur (lucCage plus lucKey) (Extended Data Fig. 2g), comme prévu dans nos simulations de modèles (Extended Data Fig. 1c). lucCageBIM a SmBiT à la position 312 dans le verrou (SmBiT312) (Extended Data Fig. 2d); la cage avec ce placement (lucCage) a été utilisée comme échafaudage de base pour les biocapteurs décrits ci-dessous.

Nous avons ensuite étudié l'incorporation d'une gamme de modalités de liaison pour les analytes d'intérêt dans lucCage en développant des méthodes pour la mise en cage informatique des protéines de liaison à la cible, plutôt que des peptides, à l'état fermé (méthodes supplémentaires). À titre de cas test, nous avons mis en cage la protéine de liaison de l'hémagglutinine (HA)21 de la grippe A H1 conçue de novo HB1.9549.2 dans une version raccourcie du commutateur LOCKR22 (sCage), optimisée pour améliorer la stabilité et faciliter les efforts de cristallisation (Fig. 2a). Deux des cinq conceptions étaient fonctionnelles et liaient HA en présence mais pas en l'absence de clé (Extended Data Fig. 3b). La structure cristalline de la meilleure conception, sCageHA_267-1S, déterminée à une résolution de 2,0 Å (tableau supplémentaire 1, code 7CBC de la banque de données protéiques (PDB)), a montré que tous les résidus d'interface de liaison HA sauf un (Phe273) interagissent avec le domaine de la cage (blocage de la liaison du verrou à la cible) comme prévu par la conception (Fig. 2a, Données étendues Fig. 3a – c).

a, validation structurelle de sCageHA_267-1S, qui met en cage une protéine de liaison grippale conçue à l'intérieur d'un commutateur LOCKR. À gauche, modèle de conception du liant de novo HB1.9549.2 (ruban cyan) lié à la région souche de l'hémagglutinine grippale (HA, ruban vert)21. A droite, structure cristalline (code PDB 7CBC) de sCageHA_267_1S, comprenant HB1.9549.2 (cyan) greffé dans une version raccourcie et stabilisée du switch LOCKR22 (sCage, ruban jaune). Au milieu, tous les résidus de HB1.9549.2 impliqués dans la liaison à HA (magenta, en haut) à l'exception de F273 sont enterrés à l'état fermé de l'interrupteur (en bas). Les étiquettes magenta indiquent le même ensemble d'acides aminés dans les deux panneaux (par exemple, F2 dans le panneau supérieur correspond à F273 dans le panneau inférieur). b–d, Caractérisation fonctionnelle de lucCageBot (b), lucCageProA (c) et lucCageHER2 (d). À gauche, les modèles structurels incorporent un liant conçu de novo pour BoNT/B (Bot.671.2)21 (b) le domaine C de la protéine A (SpA C)23 (c) ou un affibody de liaison HER224 (d) dans lucCage (bleu ruban) avec un fragment SmBiT en cage (ruban d'or). Au milieu, mesure de l'intensité de la luminescence après addition de 50 nM d'analyte (BoNT/B (b), IgG Fc (c) ou HER2 (d)) à un mélange de 10 nM de chaque lucCage et 10 nM de lucKey. À droite, détection sur une large gamme de concentrations d'analytes en modifiant la concentration du biocapteur (lucCage plus lucKey) (lignes colorées). Toutes les expériences ont été réalisées en triple, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

Avec cette validation structurelle du concept de conception, nous avons ensuite cherché à développer des capteurs pour la neurotoxine botulique B (BoNT/B), le domaine Fc de l'immunoglobuline et le récepteur HER2. Nous avons greffé un liant conçu de novo pour la neurotoxine botulique (Bot.0671.2)21, le domaine C de la protéine générique de liaison aux anticorps A23 et un affibody24 de liaison à HER2 dans lucCage. Après avoir examiné quelques conceptions pour chaque cible (Extended Data Figs. 4, 5), nous avons obtenu des lucCages très sensibles (lucCageBot, lucCageProA et lucCageHER2) capables de détecter la BoNT/B (Fig. 2b, Extended Data Fig. 4), les IgG humaines Domaine Fc (Fig. 2c, données étendues Fig. 5a – d) et récepteur HER2 (Fig. 2d, données étendues Fig. 5e – h), respectivement, démontrant la modularité de la plate-forme. Les capteurs conçus répondent en quelques minutes après l'ajout de la cible, et leur sensibilité peut être réglée en modifiant la concentration de lucCage et de lucKey (Fig. 2). Avec un développement ultérieur, ces capteurs pourraient permettre la détection rapide et à faible coût des neurotoxines botuliques dans l'industrie alimentaire25, et la détection des niveaux sérologiques de HER2 soluble (> 15 ng ml-1 ; dans la plage de détection de lucCageHER2) associés aux métastases mammaires. cancer26.

Nous avons ensuite conçu des capteurs pour la troponine I cardiaque, qui est le biomarqueur standard de diagnostic précoce de l'infarctus aigu du myocarde27. Nous avons tiré parti des interactions de haute affinité entre les troponines cardiaques T, C et I (cTnT, cTnC et cTnI, respectivement) (Fig. 3a) et conçu 11 candidats biocapteurs en insérant 6 séquences cTnT tronquées à différentes positions de verrouillage (Extended Data Fig. .6a). Le meilleur candidat, lucCageTrop627, a été capable de détecter la cTnI mais pas à des niveaux suffisamment bas pour une utilisation clinique, car les niveaux d'inclusion et d'exclusion du test de cTnI pour le diagnostic des patients atteints d'infarctus aigu du myocarde se situent dans la plage picomolaire basse27. Étant donné que la limite de détection (LOD) de notre plate-forme de capteurs est d'environ 0, 1 × Kd de l'affinité verrou-cible (KLT), nous avons cherché à améliorer la sensibilité de lucCageTrop627 en augmentant l'affinité de liaison cTnI. Nous avons fusionné cTnC à l'extrémité C-terminale du capteur pour tirer parti de l'interaction de haute affinité entre les trois troponines cardiaques (Extended Data Fig. 6b – d). Le capteur résultant, lucCageTrop, a une LOD picomolaire à un chiffre qui convient à la quantification d'échantillons cliniques (Fig. 3b, Extended Data Fig. 6e, f).

a, Conception du capteur cTnI. A gauche, structure de la troponine cardiaque (code PDB 4Y99). cTnT, cTnC et cTnI sont représentés respectivement en cyan, vert et magenta. À droite, modèle de conception de lucCageTrop. b, à gauche, le signal de luminescence augmente après l'ajout de 1 nM de cTnI à 0,1 nM de lucCageTrop plus lucKey. A droite, large plage de détection accessible en modifiant la concentration des composants du capteur (lignes colorées). La zone grise indique la plage de concentration de cTnI pertinente pour le diagnostic d'infarctus aigu du myocarde27 ; la ligne pointillée indique le seuil clinique pour l'infarctus aigu du myocarde défini par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) (0,6 ng ml-1, 25 pM). c, modèles de conception de capteurs VHB (or, SmBiT ; gris, lieur ; magenta, épitope préS1 du VHB). d, lucCageHBVα avec deux copies d'épitopes a une plus grande affinité par interférométrie de biocouche pour l'anticorps anti-VHB HzKR127-3.2 (Kd = 0,68 nM) que lucCageHBV (Kd = 20 nM). e, à gauche, le signal de luminescence augmente après l'ajout de 50 nM d'anticorps anti-HBV à 1 nM de lucCageHBVα plus lucKey. Détection correcte et sensible des anticorps anti-VHB sur une large plage de concentration. f, mécanisme de détection de preS1 à l'aide de lucCageHBV. g, Cinétique de la bioluminescence après l'ajout de l'anticorps anti-HBV ('1') et par la suite preS1 ('2'), qui diminue la bioluminescence en entrant en compétition avec le capteur pour l'anticorps. h, La détection de preS1 peut être obtenue sur les niveaux de concentration pertinents post-infection par le VHB (zone grise) en faisant varier la concentration d'anticorps (indiquée par des étiquettes colorées). Toutes les expériences ont été réalisées en triple, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

La détection d'anticorps spécifiques est importante pour surveiller la propagation d'un agent pathogène dans une population28, le succès de la vaccination29 et les niveaux d'anticorps thérapeutiques9. Pour adapter notre système aux analyses sérologiques des anticorps, nous avons cherché à incorporer dans lucCage des épitopes linéaires reconnus par les anticorps d'intérêt. Nous avons d'abord développé un capteur d'anticorps dirigés contre le domaine préS1 de la protéine de surface L30 du virus de l'hépatite B (VHB). Le meilleur des huit modèles testés, appelé « lucCageHBV », présentait une augmentation d'environ 150 % de l'activité de la luciférase après l'ajout de l'anticorps anti-VHB HzKR127-3.231 (données étendues Fig. 7a–d). Pour améliorer encore la plage dynamique et la LOD de lucCageHBV (Extended Data Fig. 7e), nous avons introduit une deuxième copie du peptide à la fin du verrou pour augmenter l'affinité du verrou avec l'anticorps bivalent (KLT) (Fig. 3c, d) . La conception résultante, appelée «lucCageHBVα», avait une LOD de 260 pM et une plage dynamique de 225% (Fig. 3e, Extended Data Fig. 7g – i), avec une intensité de luminescence facilement détectable avec une caméra (Extended Data Fig. 7j). Étant donné que les concentrations de la plupart des anticorps thérapeutiques dans le sérum se situent dans la gamme micromolaire à nanomolaire9, cette plateforme devrait être utile pour surveiller les concentrations d'anticorps thérapeutiques en circulation32.

Nous avons ensuite cherché à utiliser le capteur lucCageHBV pour détecter l'antigène de surface du VHB. Étant donné que nos capteurs sont sous contrôle thermodynamique, nous avons émis l'hypothèse que le complexe capteur-anticorps pré-assemblé se rééquilibrerait en présence de la protéine cible de l'antigène de surface du VHB preS1, l'anticorps se redistribuant pour se lier au preS1 libre au lieu de l'épitope sur lucCageHBV (Fig. .3f). La luminescence du mélange lucCageHBV plus HzKR127-3.2 a diminué peu de temps après l'ajout du domaine preS1 (Fig. 3g); la sensibilité de cette lecture a permis de quantifier la concentration de preS1 dans la plage cliniquement pertinente33 (Fig. 3h, Extended Data Fig. 7f).

La pandémie de COVID-19 a créé un besoin urgent d'outils de diagnostic pour le virus SARS-CoV-2 et les anticorps antiviraux3. Pour concevoir des capteurs pour les anticorps anti-SARS-CoV-2, nous avons d'abord identifié dans la littérature des épitopes linéaires hautement immunogènes dans les protéomes du SARS-CoV34,35 et du SARS-CoV-236 qui ne sont pas présents dans les souches "communes" de Coronaviridae. Parmi ceux-ci, nous nous sommes concentrés sur deux épitopes des protéines membranaires (M) et de la nucléocapside (N) qui sont reconnus par les sérums de patients atteints du SRAS et de la COVID-1935,36 et pour lesquels des anticorps d'origine animale à réaction croisée sont disponibles dans le commerce (Méthodes ). Nous avons conçu des capteurs pour chaque épitope et identifié des conceptions qui répondaient spécifiquement aux anticorps anti-membrane et anti-nucléocapside (données étendues Fig. 8a, b). Ces capteurs ont atteint un signal complet en 2 à 5 minutes et avaient une plage dynamique d'environ 50 à 70 % en réponse à de faibles quantités nanomolaires d'anticorps (Fig. 4a, b, Extended Data Fig. 8c, d).

a, à gauche, le capteur lucCageSARS2-M incorpore deux copies de l'épitope 1–17 de la protéine membranaire SARS-CoV-2 (rouge) relié à un espaceur flexible. Milieu, cinétique d'activation de la luminescence de 50 nM lucCageSARS2-M plus lucKey après l'ajout de 100 nM d'anticorps polyclonaux de lapin anti-SARS-CoV-1-M (pAb) qui réagissent de manière croisée avec les résidus 1 à 17 du SARS-CoV- 2 protéines membranaires. À droite, réponse de 5 nM lucCageSARS2-M plus lucKey à différentes concentrations d'anticorps polyclonal anti-M cible. b, à gauche, lucCageSARS2-N incorpore deux copies de l'épitope 369–382 de la protéine nucléocapside du SRAS-CoV-2 (bleu clair). Milieu, cinétique d'activation par luminescence de 50 nM lucCageSARS2-N plus lucKey après l'ajout de 100 nM d'anticorps monoclonal de souris anti-SARS-CoV-1-N (clone 18F629.1) qui reconnaît l'épitope. À droite, réponse de 50 nM lucCageSARS2-N plus lucKey à une concentration variable d'anticorps monoclonal anti-N. c, à gauche, lucCageRBD incorpore un liant4 RBD SARS-CoV-2 de novo (LCB1, magenta). Au milieu, les intensités de luminescence augmentent après l'ajout de 16,7 nM de SARS-CoV-2 RBD ou de protéine de pointe trimérique à un mélange de 1 nM de lucCageRBD plus lucKey. À droite, détection sur une plage de concentrations d'analyte dans un tampon, une matrice nasale synthétique à 10 %38 ou un sérum à 10 %. d, Spécificité du biocapteur. Chaque capteur à 1 nM a été incubé avec 50 nM de sa cible apparentée (lignes magenta) et les cibles des autres biocapteurs (lignes grises). Les cibles sont BCL-2, BoNT/B, IgG Fc humain, HER2, cTnI, anticorps anti-HBV (HzKR127-3.2), anticorps polyclonal anti-SARS-CoV-1-M et SARS-CoV-2 RBD. Toutes les expériences ont été réalisées en triple, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

Pour créer des capteurs capables de détecter directement les particules virales du SRAS-CoV-2, nous avons intégré un liant d'affinité picomolaire conçu de novo au domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 nommée LCB14 dans le format lucCage (Fig. .4c). Sur 13 candidats testés, le meilleur, que nous appelons « lucCageRBD », pouvait détecter à la fois le RBD monomère et la protéine de pointe SARS-CoV2 trimérique complète37 avec respectivement 15 pM et 47 pM LOD, et une plage dynamique de plus de 1 700 % pour la détection RBD (Fig. 4c, Extended Data Fig. 9). Nous avons encore augmenté la plage dynamique de lucCageRBD à 5 300 % en ajustant l'affinité cage-clé (KCK) en raccourcissant lucKey (Extended Data Fig. 10a – c). En plus de la détection de virus, le capteur RBD pourrait également être utilisé pour surveiller la génération d'anticorps en réponse à la vaccination en utilisant un format de compétition analogue à celui décrit ci-dessus pour la détection des anticorps anti-VHB (Fig. 3f) - la capacité de quantifier les réponses sur un large la plage dynamique et pour distinguer les anticorps neutralisants se liant au site de liaison ACE2 sur le RBD (et donc en concurrence avec LCB1 dans le capteur) des anticorps non neutralisants se liant ailleurs sont des avantages potentiels par rapport aux dosages à flux latéral.

Pour évaluer la capacité de notre plate-forme de capteurs à fonctionner dans des matrices biologiques complexes, nous avons comparé la détection RBD par lucCageRBD dans un tampon, une matrice nasale simulée38 et du sérum humain, et n'avons observé qu'une réduction mineure dans les deux dernières conditions (Fig. 4c). Suite à une suggestion de M. Merkx39, nous avons contrôlé la variation du signal de luminescence absolue dans des échantillons de sérum enrichis de quatre donneurs différents et une matrice nasale simulée enrichie à l'aide d'une référence BRET40 pour l'étalonnage interne, et avons constaté qu'avec un tel étalonnage, le RBD pouvait être quantifié avec précision sans compromettant la plage dynamique du capteur (Extended Data Fig. 11). Ces résultats suggèrent que le système lucCage pourrait être utilisé dans les dispositifs de diagnostic au point de service.

Pour tester la spécificité des biocapteurs conçus, nous avons mesuré la cinétique d'activation de chaque lucCage en réponse à chacune des cibles une à la fois. Chaque capteur a répondu rapidement et avec sensibilité à sa cible apparentée, mais pas à aucun des autres (Fig. 4d). Pour la plupart, les capteurs réels (tableaux supplémentaires 2, 3) ont fonctionné comme prévu par le modèle thermodynamique simple ; par exemple, des expériences à différentes concentrations de clé et de capteur suggèrent un faible couplage entre les paramètres. Cependant, il existe une variation considérable entre les différents capteurs dans le niveau d'activation à des concentrations cibles saturantes ou à des concentrations élevées de lucKey, qui pour la plupart sont inférieures à celles attendues pour la reconstitution complète de la luciférase prédite par le modèle (Extended Data Fig. 10d – g, Supplémentaire Tableau 4). Cela peut être une conséquence de l'interférence stérique entre la liaison de la cible au verrou et la reconstitution de la luciférase car le motif de liaison à la cible et la luciférase SmBiT sont adjacents l'un à l'autre dans le verrou ; une telle interférence pourrait être résolue en augmentant la séparation entre les deux dans le commutateur. Le potentiel du système lucCage est illustré par la plage dynamique élevée (5 300 %) et la sensibilité picomolaire du capteur lucCageRBD : la valeur de Kopen presque optimale se traduit par un bruit de fond très faible en l'absence de cible sans compromettre l'étendue de l'activation à faible cible concentrations.

Il est instructif de replacer nos capteurs dans le contexte des nombreuses plates-formes de biocapteurs à base de protéines qui ont été développées au fil des ans avec un succès considérable (discussion supplémentaire, tableau supplémentaire 5). Notre plate-forme de capteurs est basée sur le couplage thermodynamique entre les états fermés et ouverts définis du système, et ainsi, sa sensibilité dépend du changement d'énergie libre qui se produit après que le domaine de détection se lie à la cible mais pas de la géométrie spécifique de l'interaction de liaison ( les capteurs semi-synthétiques à petites molécules10,11 ont également cette propriété). Cela permet l'incorporation de diverses modalités de liaison, y compris de petits peptides, des mini-protéines globulaires, des épitopes d'anticorps et des liants conçus de novo, pour générer des capteurs sensibles pour une large gamme de cibles protéiques avec peu ou pas d'optimisation. Pour les applications au point de service, notre système, similaire à d'autres plates-formes de biocapteurs de protéines basées sur la bioluminescence8, présente les avantages d'être homogène, sans lavage et d'une lecture presque instantanée ; la quantification de la luminescence peut être réalisée avec des dispositifs peu coûteux et accessibles tels que l'appareil photo d'un téléphone portable8. En milieu hospitalier, la possibilité de concevoir de manière modulaire des capteurs avec des lectures identiques pour diverses cibles pourrait permettre la lecture rapide d'un grand nombre de composés différents à l'aide d'un ensemble de centaines de capteurs différents.

Jusqu'à récemment, la conception de protéines de novo se concentrait sur la conception de protéines avec de nouvelles structures correspondant à des minima d'énergie libre profonds uniques ; nos résultats mettent en évidence les progrès dans le domaine qui permettent désormais de générer facilement des systèmes multi-états plus complexes. Semblables à d'autres protéines conçues de novo, nos capteurs sont exprimés à des niveaux élevés dans les cellules et sont très stables41, ce qui devrait considérablement faciliter leur fabrication et leur distribution. Comme le soulignent les performances exceptionnelles du capteur lucCageRBD, il existe une forte synergie entre l'architecture générale de «dispositif moléculaire» de notre plate-forme et les liants de mini-protéines à haute affinité conçus de novo4,21 (ces mini-protéines de novo sont également efficaces avec d'autres plateformes42). À mesure que la puissance de la conception informatique continue d'augmenter, il devrait devenir possible de détecter une gamme toujours plus large de cibles avec une sensibilité plus élevée à l'aide de capteurs lucCage. Au-delà des biocapteurs, nos résultats mettent en évidence le potentiel de la conception de protéines de novo pour créer des solutions plus générales aux défis actuels que celles qui peuvent être obtenues en réaffectant des protéines natives qui ont évolué pour résoudre des défis complètement différents.

Le SmBiT 114 de faible affinité (VTGYRLFEEIL) 18 a été greffé dans le verrou du commutateur LOCKR asymétrique décrit précédemment à l'aide de GraftSwitchMover, un algorithme de conception de protéines basé sur RosettaScripts (voir Méthodes supplémentaires pour plus de détails). La gamme d'échantillonnage de greffage a été attribuée entre les résidus 300 et 330. Les conceptions résultantes ont été minimisées en énergie, inspectées visuellement et sélectionnées pour la synthèse ultérieure de gènes, la production de protéines et les analyses biochimiques. La meilleure position SmBit sur le verrou a été déterminée expérimentalement comme étant une insertion au niveau du résidu 312, comme décrit dans les données étendues Fig. 2. Cette conception a été nommée lucCage. lucKey a été assemblé en fusionnant génétiquement le LgBit de NanoLuc18 au peptide clé décrit précédemment2. Toutes les séquences de protéines sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 6.

Pour les peptides et les épitopes, la séquence d'acides aminés de chaque domaine de détection a été greffée à l'aide de Rosettascripts43 GraftSwitchMover dans tous les registres α-hélicoïdaux entre les résidus 325 et 359 de lucCage. Dans les cas où la séquence souhaitée à insérer dépassait la longueur du verrou lucCage, nous avons utilisé Rosetta Remodel44 pour modéliser l'extension C-terminal de lucCage (voir Méthodes supplémentaires pour plus de détails). Les lucCages résultants ont été minimisés en énergie à l'aide de Rosetta fast relax45, inspectés visuellement et généralement moins de dix modèles ont été sélectionnés pour la production de protéines et la caractérisation biochimique ultérieures.

Pour les domaines protéiques, le principal segment d'élément de structure secondaire formant l'interface du domaine protéique de liaison avec la cible a été identifié. La séquence d'acides aminés a été extraite et greffée dans lucCage en utilisant GraftSwitchMover ou Rosetta Remodel comme décrit ci-dessus. Ensuite, nous avons utilisé MergePDBMover et Pymol 2.0 pour aligner, modéliser et visualiser le domaine de liaison pleine longueur dans le contexte du commutateur (voir Méthodes supplémentaires pour plus de détails). Les conceptions ont été économisées en énergie à l'aide de la relaxation rapide Rosetta et inspectées visuellement pour la sélection.

Les séquences protéiques conçues ont été optimisées en codons pour l'expression d'E. coli et ordonnées en tant que gènes synthétiques dans les vecteurs d'expression pET21b+ ou pET29b+ d'E. coli. Le gène synthétique a été inséré aux sites NdeI et Xhol de chaque vecteur, y compris une étiquette hexahistidine N-terminale suivie d'un site de clivage de la protéase TEV et un codon d'arrêt a été ajouté à l'extrémité C-terminale.

La souche E. coli Lemo21(DE3) (NEB) a été transformée avec un plasmide pET21b+ ou pET29b+ codant pour le gène d'intérêt synthétisé. Les cellules ont été cultivées pendant 24 h dans du milieu LB additionné de carbénicilline ou de kanamycine. Les cellules ont été inoculées à un rapport de 1:50 ml dans le milieu d'autoinduction Studier TBM-5052 additionné de carbénicilline ou de kanamycine, cultivées à 37 ° C pendant 2 à 4 h, puis cultivées à 18 ° C pendant 18 h supplémentaires. Les cellules ont été recueillies par centrifugation à 4 000 g à 4 ° C pendant 15 min et remises en suspension dans 30 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole, 1 mM PMSF, 0,02 mg ml-1 DNase) . Les remises en suspension cellulaire ont été lysées par sonication pendant 2,5 min (cycles de 5 s). Les lysats ont été clarifiés par centrifugation à 24 000 g à 4 ° C pendant 20 min et passés à travers 2 ml de résine de nickel Ni-NTA (Qiagen, 30250) pré-équilibrée avec un tampon de lavage (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 30 mM d'imidazole). La résine a été lavée deux fois avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon de lavage, puis éluée avec 3 CV de tampon d'élution (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazole 300 mM). Les protéines éluées ont été concentrées à l'aide d'unités de filtre centrifuge Ultra-15 (Amicon) et purifiées davantage à l'aide d'une colonne d'exclusion de taille Superdex 75 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) dans du TBS (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) . Les fractions contenant des protéines monomères ont été regroupées, concentrées et congelées instantanément dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C.

Un lecteur de microplaques Synergy Neo2 (BioTek) a été utilisé pour toutes les mesures de bioluminescence in vitro. Les dosages ont été effectués dans 50 % de DPBS avec du calcium (Gibco) plus 50 % de tampon de test Nano-Glo (Promega) pour les capteurs cTnI et 50 % de HBS-EP (GE Healthcare Life Sciences) plus 50 % de tampon de test Nano-Glo ont été utilisés pour les autres capteurs. 10 × lucCage, 10 × lucKey et 10 × protéines cibles des concentrations souhaitées ont d'abord été préparées à partir de solutions mères. Pour chaque puits d'une plaque blanche opaque de 96 puits, 10 μl de 10× lucCage, 10 μl de 10× lucKey et 20 μl de tampon ont été mélangés pour atteindre la concentration et le rapport indiqués. Les composants lucCage et lucKey ont été incubés pendant 60 min à température ambiante pour permettre le pré-équilibrage. La plaque a été centrifugée à 1 000 g pendant 1 min et incubée à température ambiante pendant 10 min supplémentaires. Ensuite, 50 μl de furimazine diluée 50x (réactif de dosage de la luciférase Nano-Glo, Promega) ont été ajoutés à chaque puits. Pour les tests contenant du sérum ou une matrice nasale simulée (110 mM NaCl, 1 % (p/v) de mucine, 10 μg ml-1 d'ADN génomique humain38), la composition du tampon a été remplacée par la matrice biologique. Des mesures de bioluminescence en l'absence de cible ont été prises toutes les 1 min après l'injection (intégration de 0,1 s et agitation de 10 s pendant les intervalles). Après environ 15 min, 10 μl de protéine cible 10 × diluée en série plus un blanc ont été injectés et l'acquisition cinétique de bioluminescence s'est poursuivie pendant un total de 2 h. Pour dériver les valeurs de concentration efficace demi-maximale (EC50) du tracé de la bioluminescence à l'analyte, les trois intensités de bioluminescence maximales aux concentrations individuelles de l'analyte ont été moyennées, soustraites du blanc et utilisées pour s'adapter à la courbe sigmoïdale 4PL. Pour calculer la LOD, la région linéaire des réponses de bioluminescence des capteurs à son analyte a été extraite et une courbe de régression linéaire a été obtenue. Il a été utilisé pour dériver l'écart type de la réponse et la pente de la courbe d'étalonnage (S). La LOD a été déterminée comme suit : 3 × (sd/S).

Les échantillons de sérum provenaient d'un excès de plasma ou de sérums d'adultes (>18 ans) des deux sexes fournis par le directeur de la division de chimie clinique de l'hôpital de l'Université de Washington. Tous les échantillons de donneurs anonymisés ont été fournis anonymisés. Étant donné que les donneurs ont consenti à ce que leurs échantillons excédentaires soient utilisés pour d'autres études expérimentales, ils ont pu être transférés dans notre étude sans consentement supplémentaire. Tous les échantillons ont été passés à travers des filtres de 0,22 μm avant utilisation. Dix microlitres de RBD monomère dilué en série 10 × (167–0,69 nM), 5 μl de 20 × lucCage (20 nM), 5 μl de 20 × lucKey (20 nM), 5 μl de 20 × Antares2 (2 nM), et 10, 20, 25 ou 50 μl de sérum de donneur humain ou de matrice nasale simulée ont été mélangés avec du tampon de test HBS:Nano-Glo 1: 1 pour atteindre un volume total de 75 μl. La plaque a été centrifugée à 1 000 g pendant 1 min. Ensuite, 25 μl de furimazine diluée 25x dans du tampon ont été ajoutés à chaque puits. Les signaux de bioluminescence ont été enregistrés à partir des canaux 470/40 nm et 590/35 nm toutes les 1 min pendant un total de 1 h. Le rapport à chaque point dans le temps a été calculé par l'équation décrite dans les données étendues de la figure 11b. Le SARS-CoV-2 RBD monomère a été exprimé et purifié comme décrit précédemment46.

Les interactions protéine-protéine ont été mesurées à l'aide d'un système Octet RED96 (ForteBio) utilisant des biocapteurs revêtus de streptavidine (ForteBio). Chaque puits contenait 200 μl de solution et le tampon de dosage était un tampon HBS-EP+ (GE Healthcare Life Sciences, 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % (v/v) de surfactant P20) plus 0,5 % bloqueur de qualité pour buvardage de lait en poudre non gras (BioRad). Les pointes du biocapteur ont été chargées de peptide ou de protéine analyte à 20 μg ml-1 pendant 300 s (seuil de réponse de 0,5 nm), incubées dans du tampon HBS-EP+ pendant 60 s pour acquérir la mesure de base, plongées dans la solution contenant la cage et/ ou clé pendant 600 s (étape d'association) et plongé dans le tampon HBS-EP+ pendant 600 s (étapes de dissociation). Les données de liaison ont été analysées avec la version 9.0.0.10 du logiciel d'analyse de données ForteBio.

La séquence peptidique BIM (EIWIAQELRRIGDEFNAYYA) a été enfilée dans l'échafaudage lucCage comme décrit dans « Greffage informatique de domaines de détection dans lucCage ». Les conceptions sélectionnées ont été exprimées dans E. coli, purifiées et caractérisées pour l'activation de la luminescence. Le signal de détection de bioluminescence a été mesuré pour chaque conception lucCage à 20 nM mélangé avec lucKey à 20 nM, en présence ou en l'absence de la protéine cible BCL-2 à 200 nM. Le BCL-2 recombinant a été produit comme décrit précédemment47.

Les principaux motifs de liaison du liant Bot.0671.2 de novo, du domaine C de la protéine A de Staphylococcus aureus (SpaC), de l'anticorps HER2 et du liant RBD de novo LCB1 ont été enfilés dans lucCage, comme décrit dans 'Greffe informatique de domaines de détection dans lucCage' ( voir les tableaux supplémentaires 3 et 6 pour les séquences). Les conceptions sélectionnées ont été exprimées dans E. coli, purifiées et caractérisées pour l'activation de la luminescence. Les conceptions ont été criblées en mesurant le signal de bioluminescence pour chaque conception lucCage à 20 nM mélangé avec lucKey à 20 nM, en présence ou en l'absence de protéine cible à 200 nM. Les protéines cibles utilisées étaient : la neurotoxine botulique B HcB exprimée comme décrit précédemment48, l'IgG1 Fc-HisTag humain (AcroBiosystems, IG1-H5225) et l'HER2-HisTag humain (AcroBiosystems, HE2-H5225). Le SARS-CoV-2 RBD monomérique et la protéine de pointe SARS-CoV-2 trimérique (version pré-stabilisée Hexapro37) ont été exprimés et purifiés comme décrit précédemment46.

La séquence du motif de liaison cTnT a été tronquée en fragments de longueur différente (Extended Data Fig. 6) et enfilée dans l'échafaudage lucCage comme décrit dans «Greffe informatique de domaines de détection dans lucCage». Les conceptions sélectionnées ont été exprimées dans E. coli, purifiées et caractérisées pour l'activation de la luminescence. Les conceptions ont été criblées en mesurant le signal de bioluminescence pour chaque conception lucCage à 20 nM mélangé avec lucKey à 20 nM en présence ou en l'absence de cTnI 100 nM (Genscript, Z03320-50). Par la suite, lucCageTrop, une version améliorée par fusion à cTnC, a été créée en fusionnant génétiquement la séquence suivante à l'extrémité C de lucCageTrop627.

Le motif de liaison (GANSNNPDWDFN) du domaine preS1 a été enfilé dans l'échafaudage lucCage à chaque position après les résidus 336 à l'aide du Rosetta GraftSwitchMover. Suite au protocole Rosetta FastRelax, huit conceptions ont été sélectionnées pour la production de protéines. Les conceptions ont été criblées en mesurant le signal de bioluminescence pour chaque conception lucCage (20 nM) et lucKey (20 nM) en présence ou en l'absence de l'anticorps anti-HVB HzKR127-3.2 (100 nM) pour sélectionner lucCageHBV. Par la suite, lucCageHBVα a été construit en fusionnant génétiquement une séquence contenant un deuxième motif antigénique (GGSGGGSSGFGANSNNPDWDFNPN) à lucCageHBV.

Des épitopes antigéniques de la protéine membranaire du SRAS-CoV-2 (acides aminés 1–31, 1–17 et 8–24) et de la protéine de la nucléocapside (acides aminés 368–388 et 369–382) ont été greffés par ordinateur dans lucCage comme décrit dans ' Greffe informatique de domaines de détection dans lucCage'. Les conceptions sélectionnées ont été exprimées dans E. coli, purifiées et caractérisées pour l'activation de la luminescence. Toutes les conceptions à 50 nM ont été mélangées avec 50 nM lucKey et testées expérimentalement pour une augmentation de la luminescence en présence d'anticorps polyclonaux membranaires anti-SARS-CoV de lapin (ProSci, 3527) à 100 nM ou d'anticorps monoclonal de nucléocapside anti-SARS-CoV de souris (clone 18F629.1, NovusBio NBP2-24745) à 100 nM.

HB1.9549.2 a été intégré dans le faisceau parental à six hélices pour la conception de sCage à différentes positions le long de l'hélice de verrouillage de l'échafaudage. Pour favoriser des interactions intramoléculaires plus favorables, trois résidus consécutifs sur le verrou ont été intentionnellement remplacés par de la glycine pour permettre une liberté conformationnelle. Les cinq conceptions ont été produites dans E. coli. L'analyse par interférométrie de la biocouche a été réalisée avec des cages purifiées (1 μM) et de la grippe A H1 HA21 biotinylée chargée sur des pointes de biocapteur recouvertes de streptavidine (ForteBio) en présence ou en l'absence de la clé (2 μM) à l'aide d'un instrument Octet (ForteBio).

Les fragments d'ADN VH et VL synthétiques ont été sous-clonés dans le plasmide pdCMV-dhfrC-cA10A3 contenant les séquences d'ADN Cy1 et Cy humain. Le vecteur a été introduit dans des cellules HEK 293F à l'aide de Lipofectamine (Invitrogen) et les cellules ont été cultivées dans FreeStyle 293 (GIBCO) dans 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié à 37 °C. Le surnageant de culture a été chargé sur une colonne de protéine A-sépharose (Millipore) et l'anticorps lié a été élué par l'ajout de glycine-HCl 0,2 M (pH 2,7), suivi d'une neutralisation immédiate avec du Tris-HCl 1 M (pH 8,0) . La solution a été dialysée contre HEPES-NaOH 10 mM (pH 7,4) et la pureté de la protéine a été analysée par SDS-PAGE.

Le fragment d'ADN codant pour le domaine préS1 (résidus 1 à 56) a été cloné dans le plasmide pGEX-2T (GE Healthcare) et la protéine a été produite dans la souche E. coli BL21(DE3) (NEB) à 18 °C en tant que protéine de fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) à l'extrémité N-terminale. Les lysats cellulaires ont été préparés dans une solution tampon (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 300 mM) et le surnageant clarifié a été chargé sur de la résine GSTBind (Novagen). Le domaine GST – preS1 a été élué avec le même tampon contenant du glutathion réduit supplémentaire de 10 mM, purifié davantage à l'aide d'une colonne d'exclusion de taille Superdex 75 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) et concentré à 34 μM.

sCageHA_267-1S et sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y) ont été exprimés à 18 °C dans la souche E. coli LEMO21(DE3) (NEB) en tant que protéine de fusion contenant un domaine de cystéine protéase (CPD) étiqueté (His)10 dérivé de Vibrio cholerae49 à l'extrémité C-terminale. La protéine a été purifiée à l'aide d'une résine de nickel HisPur (Thermo), d'une colonne échangeuse d'anions HiTrap Q (GE Healthcare) et d'une colonne de filtration sur gel HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare). Pour le marquage à la sélénométhionine (SelMet), une mutation I30M a été introduite en plus pour générer un variant sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M). Cette protéine a été exprimée dans la souche E. coli B834 (DE3) RIL (Novagen) dans le milieu minimal contenant SeMet, et purifiée selon la même procédure de purification des autres variants.

Deux mutations ponctuelles (Glu99Tyr et Thr144Tyr) ont été introduites dans le but d'induire des interactions cristallines favorables. Des monocristaux de bonne qualité de sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M) ont été obtenus dans un cadre de diffusion de vapeur en goutte suspendue par micro-ensemencement dans une solution contenant 11 % (v/v) d'éthanol, 0,25 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5). Les cristaux nécessitaient un maintien strict de la température à 25 °C. Pour la cryoprotection, les cristaux ont été trempés brièvement dans la solution de cristallisation additionnée de 15 % de 2,3-butanediol et refroidis par flash dans l'azote liquide. Un ensemble de données de dispersion anormale à une seule longueur d'onde a été collecté au pic d'absorption de Se et traité avec HKL200050. Les positions Se et la carte de densité électronique initiale ont été calculées à l'aide du module AutoSol dans PHENIX51. La construction du modèle et le raffinement de la structure ont été réalisés en utilisant COOT52 et PHENIX.

Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Aucun échantillon n'a été exclu de l'analyse des données et aucune mise en aveugle n'a été utilisée. Des échantillons de sérum cliniques anonymisés ont été utilisés au hasard pour ajouter des protéines cibles. Les résultats ont été reproduits avec succès en utilisant différents lots de protéines pures à différents jours. Sauf indication contraire, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type et les barres d'erreur dans les figures représentent l'écart-type du triple exemplaire technique. Les données d'interférométrie de la biocouche ont été analysées à l'aide du logiciel d'analyse de données ForteBio version 9.0.0.10. Toutes les données ont été analysées et tracées à l'aide de GraphPad Prism 8.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques de sCageHA_267-1S ont été déposées dans la PDB sous le code d'accession 7CBC. Les données expérimentales originales qui appuient les conclusions de ce travail sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants. Les plasmides codant pour les protéines biocapteurs décrites dans cet article sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

Les modèles de conception et le code RosettaScripts utilisés dans le manuscrit ont été déposés sur http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/designcode_and_models.zip. Le code des simulations numériques présentées dans ce manuscrit est disponible sur http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/model_simulation.py

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Nous reconnaissons le financement de HHMI (DB), de la Fondation LG Yonam (B.-HO), du projet BK21 PLUS de Corée (HL), du United World Antiviral Research Network (UWARN), l'un des centres de recherche sur les maladies infectieuses émergentes 'CREID' , NIAID 1 U01 AI151698-01 (DB, LS et H-.WY), The Audacious Project at the Institute for Protein Design (DB, H-.WY, CMC and MCM), Eric et Wendy Schmidt sur recommandation du Schmidt Futures (AQ-.R. et H-.WY), la Washington Research Foundation (JP et MJL), le Nordstrom Barrier Institute for Protein Design Directors Fund (RAL), The Open Philanthropy Project Improving Protein Design Fund (DB et SEB), le don de soutien de Gree Real Estate (AQ-R.), de la Fondation 'la Caixa' (AQ-R., ID 100010434 sous subvention LCF/BQ/AN15/10380003), du soutien 1U19AG065156-01 (DB) et de l'Air Force Office de la Recherche Scientifique FA9550-18-1-0297 (DB). Nous remercions M. Wener pour la collecte d'échantillons de sérums humains anonymisés, WC Van Voorhis pour ses conseils et son soutien avec les capteurs d'anticorps anti-SARS-CoV-2, N. Panpradist et B. Lutz pour avoir fourni une matrice nasale simulée, S. Berger pour partageant la cible protéique BCL-2, DA Silva Manzano pour avoir fourni la neurotoxine botulique B, A. Kang pour la mise en place de plateaux de cristal de dépistage, et L. Carter, B. Fiala et l'Institute for Protein Design pour avoir fourni SARS-CoV-2 RBD et protéine de pointe. Nous remercions M. Merkx d'avoir suggéré le référencement BRET interne pour contrôler les fluctuations d'échantillon à échantillon dans l'activité de la luciférase. Les données de rayons X ont été recueillies sur la Beamline 5C au Pohang Accelerator Laboratory, en Corée. Toutes les images de structure et de modèle de protéine ont été générées à l'aide de PyMOL 2.0.

Parc Joo Young

Adresse actuelle : Sana Biotechnology, Inc, Seattle, WA, États-Unis

Robert A. Langan, Scott E. Boyken et Marc J. Lajoie

Adresse actuelle : Outpace Bio, Inc., Seattle, WA, États-Unis

Les auteurs suivants ont contribué à parts égales : Alfredo Quijano-Rubio, Hsien-Wei Yeh

Département de biochimie, Institute for Protein Design, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Alfredo Quijano-Rubio, Hsien-Wei Yeh, Jooyoung Park, Robert A. Langan, Scott E. Boyken, Marc J. Lajoie, Longxing Cao, Cameron M. Chow, Mark C. Miranda, Lance Stewart, Byung-Ha Oh & David boulanger

Département de bioingénierie, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Alfredo Quijano-Rubio

Département des sciences biologiques, KAIST Institute for the Biocentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Corée du Sud

Hansol Lee et Byung-Ha Oh

Département d'immunologie des systèmes, Collège des sciences biomédicales, Université nationale de Kangwon, Chuncheon, Corée du Sud

Jimin Wi et Hyo Jeong Hong

Howard Hughes Medical Institute, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

David Boulanger

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DB a dirigé les travaux. DB, AQ-R., H.-WY, B.-HO, JP et LS ont conçu et conceptualisé la recherche. AQ-R., JP, B.-HO et H.-WY ont réalisé la conception informatique des capteurs. AQ-R., JP et B.-HO ont exploré les premières conceptions de capteurs. H.-WY et AQ-R. optimisé la conception des capteurs pour améliorer les performances et conduit les caractérisations expérimentales. H.-WY et AQ-R. effectué la validation expérimentale. BHO a dirigé et HL a réalisé le travail cristallographique. H.-WY et RAL ont écrit le modèle thermodynamique et réalisé les simulations. RAL a écrit GraftSwitchMover. SEB et MJL ont conçu la cage parentale et les principaux échafaudages protéiques. LC a conçu le classeur RBD LCB1. CMC, MCM, JW et HJH ont effectué la purification des protéines. DB, B.-HO, AQ-R. et H.-WY a rédigé le projet original. Tous les auteurs ont examiné et accepté le manuscrit.

Correspondance avec Byung-Ha Oh ou David Baker.

DB, AQ-R., H.-WY et JP sont co-inventeurs dans une demande de brevet provisoire (numéro de demande 63/030 836 déposée par l'Université de Washington) couvrant les biocapteurs décrits dans cet article. DB, AQ-R., H.-WY, LC et LS sont co-inventeurs dans une demande de brevet provisoire (numéro de demande 63/051549 déposée par l'Université de Washington) couvrant le biocapteur SARS-CoV-2 RBD décrit dans cet article . Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Informations sur l'évaluation par les pairs Nature remercie Caryn Bern, Vincent Hilser et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a–e, simulations numériques des équilibres couplés illustrés à la Fig. 1b pour différentes valeurs de Kopen (a), KLT (b), [lucKey]tot (c), [lucCage]tot (d) et Kopen (e). Sauf indication contraire, les simulations ont été réalisées avec des valeurs fixes pour Kopen = 1 × 10−3 M, KLT = 10−9 M et KCK = 10−8 M, et la concentration des composants du capteur à 10:100 nM ([ lucCage]tot :[lucKey]tot). a, l'augmentation de ΔGopen (plus petit Kopen) déplace la réponse du capteur vers des concentrations d'analyte plus élevées. b, la LOD du capteur est d'environ 0,1 × KLT ; la force motrice d'ouverture de l'interrupteur devient trop faible en dessous de cette concentration. c, d, La plage de détection cible efficace peut être ajustée en modifiant les concentrations des deux composants du capteur. Les résultats de simulation présentés dans une échelle logarithmique (c) ou une échelle linéaire (d) pour la concentration cible illustrent que la pente de la réponse dépend du rapport de la concentration du capteur à l'interaction de liaison verrou-cible (KLT). e, les valeurs de KCK affectent les deux espèces responsables du fond et du signal (espèces 6 et 7 sur la Fig. 1b, respectivement), conduisant à différentes plages dynamiques de capteur. f, g, Simulations avec différentes valeurs de Kopen et KCK. La formation de l'espèce 6 (sur la figure 1b) est augmentée par de grandes valeurs de Kopen et de fortes interactions lucCage – lucKey (KCK). f, Une carte thermique représentant la plage dynamique calculée du capteur en fonction des valeurs Kopen et KCK. Kopen exerce un effet prédominant sur la plage dynamique et KCK fournit un ordre supplémentaire d'accordabilité. g, Une carte thermique montrant la fraction de luciférase reconstituée (sensibilité) à la concentration cible saturante, indiquant un compromis de réglage KCK.

a, modèles de protéines montrant les différentes positions de filetage de SmBiT (or) et du peptide BIM (saumon) sur l'hélice de verrouillage du commutateur de novo LOCKR (bleu). b, Dépistage expérimental de 11 capteurs BCL-2 de novo. Onze variants ont été générés en combinant les positions SmBiT et BIM en a et caractérisés par l'activation de leur luminescence après l'ajout de BCL-2. Des mesures de luminescence ont été effectuées avec chaque conception (20 nM) et lucKey (20 nM) en présence ou en l'absence de BCL-2 (200 nM). SmBiT312-BIM339 (d'où lucCageBIM) a été sélectionné pour la caractérisation postérieure en raison de sa luminosité, de sa plage dynamique et de sa stabilité plus élevées. c–g, Caractérisation de lucCageBIM. c, modèle de conception structurelle en représentation ruban. d, Vue rapprochée montrant l'interface prévue de SmBiT (or) et de la cage (bleu). e, Vue rapprochée montrant l'interface prévue du BIM (saumon) et de la cage (bleu). f, mesures de luminescence cinétique après l'ajout de BCL-2 (200 nM) à un mélange de lucCageBIM (20 nM) et de lucKey (20 nM). g, sensibilité réglable de lucCageBIM à BCL-2 en modifiant les concentrations des composants du capteur (lucCageBIM et lucKey) (courbes colorées).

a, modèles structurels de conceptions sCageHA avec le liant de novo intégré HB1.9549.2. La protéine HB1.9549.2 (cyan) a été greffée dans un faisceau parental à six hélices (sCage, jaune) à différentes positions le long de l'hélice de verrouillage (magenta), y compris trois résidus glycine consécutifs (vert). Les flèches noires indiquent la ou les mutations simples V255S (1S) ou doubles V255S/I270S (2S) introduites en plus sur le verrou. b, Validation expérimentale de cinq conceptions de sCageHA se liant à HA en présence ou en l'absence de la clé par interférométrie de biocouche. La concentration des sCages et de la clé était de 1 μM et 2 μM, respectivement. Chaque expérience a été réalisée une fois. sCageHA_267-1S a présenté le plus grand pli d'activation. c, Comparaison structurelle montrant la nature flexible de sCage pour permettre la mise en cage de HB1.9549.2. Le modèle structurel de sCage (gris) et la structure cristalline de sCageHA_267-1S (or) sont superposés, et une section étroite (boîte noire) est montrée dans une vue orthogonale pour plus de détails. L'hélice N-terminale de HB1.9549.2 est déplacée de l'hélice de verrouillage (α6) de 3,2 Å (milieu) avec un déplacement concomitant de α5 et une rupture partielle d'un réseau de liaisons hydrogène impliquant Q16 et N214 de sCage (droite). d, Une vue rapprochée des interactions intramoléculaires de sCageHA_267-1S. Les résidus de liaison HA sont mis en évidence en magenta. L'hélice N-terminale (cyan α1) et l'hélice suivante (cyan α2) de HB1.9549.2 interagissent avec la cage. Les interactions intramoléculaires sont toutes hydrophobes. La chaîne latérale hydrophobe volumineuse de F285 bute étroitement contre les atomes du squelette de α5 de sCage, ce qui est peu susceptible de se produire sans une flexion de α5. Des interactions défavorables sont également trouvées: F273 est exposé au solvant et le groupe hydroxyle Y287 est enfoui dans l'environnement apolaire. Le panneau le plus à droite montre la qualité de la carte de densité électronique.

a, modèles structurels des conceptions de capteurs BoNT/B montrant les différentes positions de filetage de Bot.0671.2 (vert, code PDB 5VID) sur le loquet de lucCage (bleu). Le peptide SmBiT est représenté en ruban d'or. I328S et L345S indiquent des mutations introduites pour ajuster l'interface verrou-cage (« 1S » désigne I328S, « 2S » désigne I328S/L345S)2, et « GGG » indique la présence de trois résidus glycine consécutifs entre le verrou et la protéine greffée. La boîte noire montre une vue rapprochée de l'interface de la cage (bleu) et Bot.0671.2 (vert) dans la conception 349_2S. b, criblage expérimental de neuf capteurs BoNT/B de novo. Des mesures de luminescence ont été effectuées pour chaque conception (20 nM) et lucKey (20 nM) en présence ou en l'absence de la protéine BoNT/B (200 nM). Les valeurs de luminescence pour chaque conception ont été normalisées à 100 en l'absence de BoNT/B. Design 349_2S a été sélectionné comme le meilleur candidat en raison de sa sensibilité et de sa stabilité élevées et a été nommé lucCageBot. c, Détermination de la sensibilité de lucCageBot. La bioluminescence a été mesurée sur 6 000 s en présence de protéine BoNT/B diluée en série. Les concentrations de lucCageBot:lucKey (en nM) étaient de 50:5, 5:5, 1:10 et 0,5:0,5 (de haut en bas). d, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. Les concentrations de lucCageBot:lucKey (en nM) étaient de 50:5, 5:5, 1:10 et 0,5:0,5 (de haut en bas). Toutes les expériences ont été réalisées en triple, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

a, modèles structurels des conceptions de capteurs Fc montrant les différentes positions de filetage du domaine C de la protéine A de S. aureus (orange, code PDB 4WWI) sur le verrou de lucCage (bleu). Le peptide SmBit est représenté en ruban d'or. I328S et L345S indiquent des mutations introduites pour ajuster l'interface verrou-cage comme dans Extended Data Fig. 4a. b, criblage expérimental de six capteurs de domaine Fc de novo. Des mesures de luminescence ont été effectuées pour chaque conception (20 nM) et lucKey (20 nM) en présence ou en l'absence d'IgG1 Fc humain recombinant (200 nM). Les valeurs de luminescence ont été normalisées à 100 en l'absence de Fc. Design 351_2S a été sélectionné comme le meilleur candidat en raison de sa sensibilité élevée et a été nommé lucCageProA. Cette expérience a été réalisée en utilisant des répétitions uniques dans deux instances indépendantes, des données représentatives sont présentées. c, Détermination de la sensibilité de lucCageProA. La bioluminescence a été mesurée sur 6 000 s en présence de protéine Fc diluée en série. Les concentrations lucCageBot:lucKey (en nM) étaient de 5: 5 (haut), 1: 10 (milieu) et 0, 5: 0, 5 (bas). d, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. Les concentrations lucCageBot:lucKey (en nM) étaient de 5: 5 (haut), 1: 10 (milieu) et 0, 5: 0, 5 (bas). e, modèles structurels des conceptions de capteurs HER2 montrant les différentes positions de filetage de la protéine affibody HER2 (code PDB 3MZW, beige) sur le verrou de lucCage (bleu), comme dans a. Les boîtes noires montrent une vue rapprochée de l'interface de la cage (bleu) et de l'afficorps HER2 (beige) dans la conception 354_2S. f, Projection expérimentale de sept capteurs HER2 de novo. Des mesures de luminescence ont été prises pour chaque conception (20 nM) et lucKey (20 nM) en présence ou en l'absence de l'ectodomaine de HER2 (200 nM). Les valeurs de luminescence ont été normalisées à 100 en l'absence d'ectodomaine HER2. Cette expérience a été réalisée en utilisant des répétitions uniques dans deux instances indépendantes, des données représentatives sont présentées. Le design 354_2S a été sélectionné comme le meilleur candidat en raison de sa sensibilité et de sa stabilité élevées, et a été nommé lucCageHER2. g, Détermination de la sensibilité de lucCagerHER2. La bioluminescence a été mesurée sur 6 000 s en présence de protéine d'ectodomaine HER2 diluée en série. Les concentrations lucCageBot:lucKey (en nM) étaient de 5: 5 (en haut), 1: 10 (en bas) et 0, 5: 0, 5 (en bas). h, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. Les concentrations lucCageBot:lucKey (en nM) étaient de 5: 5 (haut), 1: 10 (milieu) et 0, 5: 0, 5 (bas). Toutes les expériences ont été réalisées en triple sauf indication contraire, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

a, criblage expérimental de capteurs conçus pour cTnI. Des fragments de cTnT, à savoir cTnTf1-f6, ont été greffés par calcul dans lucCage à différentes positions du verrou. Tous les modèles ont été produits dans E. coli et testés expérimentalement à 20 nM et 20 nM lucKey pour une augmentation de la luminescence en présence de 100 nM cTnI. Les valeurs de luminescence ont été normalisées à 100 en l'absence de cTnI. Cette expérience a été réalisée en utilisant des répétitions uniques dans deux instances indépendantes, des données représentatives sont présentées. Le design 336-cTnTf6-K342A a été sélectionné comme meilleur candidat (nommé lucCageTrop627) sur la base de sa sensibilité, de son changement de facteur d'activation et de sa stabilité. b, modèles de lucCageTrop627 et lucCageTrop - une version améliorée produite par fusion de cTnC à l'extrémité C de lucCageTrop627. Les modèles sont présentés sous forme de ruban comprenant SmBit (or) un fragment de cTnT (cyan) (code PDB 4Y99) et cTnC (vert) (code PDB 4Y99). La boîte noire montre une vue rapprochée de l'interface de la cage (bleu) et du cTnT (cyan) dans la conception lucCageTrop. c, L'affinité de liaison de lucCageTrop627 et lucCageTrop à cTnI a été mesurée par interférométrie de biocouche. lucCageTrop a montré une affinité sept fois plus élevée pour cTnI que lucCageTrop627. d, Comparaison de la cinétique de bioluminescence entre lucCageTrop627 (en haut) et lucCageTrop (en bas) en présence de cTnI dilué en série. Une affinité de liaison plus élevée conduit à une plage dynamique et à une sensibilité améliorées du capteur. e, Détermination de la sensibilité de lucCageTrop. La bioluminescence a été mesurée sur 6 000 s en présence de cTnI dilué en série. Les concentrations lucCageTrop:lucKey (en nM) étaient de 1:10, 1:1, 0,5:0,5 et 0,1:0,1 (de haut en bas). f, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. Les concentrations lucCageTrop:lucKey (en nM) étaient de 1:10, 1:1, 0,5:0,5 et 0,1:0,1 (de haut en bas). Toutes les expériences ont été réalisées en triple, sauf indication contraire, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

a, Les modèles à énergie minimisée des conceptions lucCage sont représentés avec les segments filetés de SmBiT (or) et le motif antigénique de preS1 (magenta). La boîte de droite montre une vue rapprochée de l'interface cage-motif de la conception HBV344. b, Dépistage expérimental de tous les modèles réalisés en surveillant la luminescence de chaque lucCage (20 nM) et lucKey (20 nM) en présence ou en l'absence de l'anticorps anti-HBV HzKR127-3.2 (100 nM). Les valeurs de luminescence ont été normalisées à 100 en l'absence d'anti-HBV. Cette expérience a été réalisée en double dans deux instances indépendantes, et des données représentatives sont présentées. La conception HBV344 a été sélectionnée en raison de ses meilleures performances et a été nommée lucCageHBV. c, d, Détermination de la sensibilité lucCageHBV. La bioluminescence a été mesurée sur 6 000 s en présence de HzKR127-3.2 dilué en série. Les concentrations de lucCageHBV:lucKey étaient de 5:5 nM (en haut) et de 1:1 nM (en bas). Les valeurs maximales des courbes en d sont utilisées pour obtenir les courbes en c. e, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. Les concentrations de lucCageHBV:lucKey étaient de 5:5 nM (en haut) et de 1:1 nM (en bas). f, détection de preS1 par compétition de lucCageHBV344 et HzKR127-3.2 illustrée à la Fig. 3f. Cinétique de luminescence après addition de l'anticorps (anti-VHB, première flèche). Les concentrations d'anticorps anti-VHB étaient de 50 nM (en haut) et de 12,5 nM (en bas). À 6 000 s, différentes concentrations du domaine preS1 ont été injectées dans les puits (deuxième flèche) et les signaux de luminescence diminués ont été utilisés pour détecter preS1. g, Conception de lucCageHBVα pour une détection améliorée d'un anticorps anti-HBV. Le modèle structurel de lucCageHBVα est présenté avec un détail rapproché de l'interface prédite entre l'épitope preS1 (magenta) et lucCage (bleu). La conception comprend deux copies de l'épitope preS1 (acides aminés 35 à 46), espacées par un lieur flexible (gris) pour permettre une interaction bivalente avec l'anticorps. Le peptide SmBit est représenté en or. h, Détermination de la sensibilité de détection de lucCageHBVα à la présence de l'anticorps HzKR127-3.2 (anti-HBV). La bioluminescence a été mesurée sur 6 000 s en présence de HzKR127-3.2 dilué en série. Les concentrations lucCageHBVα:lucKey (en nM) étaient de 1:10 (en haut) et de 0,5:0,5 (en bas). i, La région linéaire d'une courbe d'étalonnage a été utilisée pour déterminer la LOD de détection d'anticorps. j, Images de bioluminescence acquises avec un système d'imagerie BioRad ChemiDoc. Les concentrations lucCageHBVα:lucKey (en nM) sont de 50:5 (en haut), 5:5 (au milieu) et 1:10 (en bas). Des changements dans les niveaux de bioluminescence ont été détectés en fonction de la concentration de HzKR127-3.2. Toutes les expériences ont été réalisées en triple sauf indication contraire, et les données représentatives sont moyennes ± sd

a, b, Dépistage expérimental de capteurs de novo pour les anticorps dirigés contre la protéine membranaire du SRAS-CoV-2 (a) et la protéine de la nucléocapside (b). Des épitopes sélectionnés de la protéine membranaire (M1, M3 et M4) et de la protéine de la nucléocapside (N6 et N62) ont été greffés par ordinateur dans lucCage à différentes positions du verrou. Chaque conception comprenait deux copies en tandem de chaque épitope, séparées par un lieur flexible, pour tirer parti de la liaison bivalente des anticorps. Toutes les conceptions ont été testées expérimentalement pour une augmentation de la luminescence à 20 nM de chaque conception lucCage et 20 nM de lucKey en présence d'anticorps polyclonaux de lapin anti-M (a) ou d'anticorps monoclonaux de souris anti-N à 100 nM (clone 18F629.1 ) (b). Ces expériences ont été réalisées en double (a) ou en répétitions simples (b) dans deux instances indépendantes, et des données représentatives sont présentées. Les valeurs de luminescence ont été normalisées à 100 en l'absence d'anticorps. Les conceptions M3_1-17_334 et N62_369-382_340 ont été sélectionnées comme les meilleurs candidats en raison de leur sensibilité et de leur stabilité élevées, et ont été nommées respectivement lucCageSARS2-M et ucCageSARS2-N. c, à gauche, modèle structurel de lucCageSARS2-M, montrant une vue rapprochée de l'interface prédite entre l'épitope M3 (rouge) et lucCage (bleu). Milieu, détermination de la sensibilité de lucCageSARS2-M à l'anticorps polyclonal anti-M. La bioluminescence a été mesurée sur 4 000 s en présence d'anticorps polyclonaux anti-M dilués en série. Les concentrations lucCageSARS2-M:lucKey (en nM) étaient de 50:50 (haut) et 5:5 (bas). À droite, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. d, à gauche, modèle structurel de lucCageSARS2-N, montrant une vue rapprochée de l'interface prédite entre l'épitope N62 (violet) et lucCage (bleu). Milieu, détermination de la sensibilité de lucCageSARS2-N à l'anticorps monoclonal anti-N. La bioluminescence a été mesurée sur 4 000 s pour lucCageSARS2-N plus lucKey à 50 nM en présence d'anticorps anti-N dilués en série. À droite, calculs LOD pour le capteur. Toutes les expériences ont été réalisées en triple sauf indication contraire, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

a, Dépistage expérimental de capteurs de novo pour le RBD de la protéine de pointe SARS-CoV-2. Toutes les conceptions ont été testées expérimentalement pour les augmentations de luminescence à 20 nM de chaque conception lucCage et 20 nM de lucKey en présence de 200 nM RBD. Les valeurs de luminescence ont été normalisées à 100 en l'absence de RBD. Cette expérience a été réalisée en double dans deux instances indépendantes, et des données représentatives sont présentées. La conception lucCageRBDdelta4_348 a été sélectionnée comme le meilleur candidat en raison de sa sensibilité et de sa stabilité élevées, et a été nommée lucCageRBD. b, Modèle structurel de lucCageRBD composé du liant LCB1 (magenta) greffé dans lucCage (bleu) comprenant un fragment SmBiT en cage (or). Les boîtes noires montrent une vue rapprochée de l'interface de la cage (bleu) et du liant LCB1 (magenta) dans la conception lucCageRBD. c, Détermination de la sensibilité de lucCageRBD. La bioluminescence a été mesurée sur 10 000 s en présence de protéine RBD diluée en série. Les concentrations de lucCageRBD:lucKey (en nM) étaient de 1:1 (en haut), 1:10 (au milieu) et 10:10 (en bas). d, calculs LOD pour le capteur à différentes concentrations. Les concentrations lucCageRBD:lucKey (en nM) étaient de 1:1 (en haut), 1:10 (au milieu) et 10:10 (en bas). e, images de bioluminescence acquises avec un système d'imagerie BioRad ChemiDoc. Des changements dans les niveaux de bioluminescence ont été détectés en fonction de la concentration de RBD avec 1 nM lucCageRBD et 10 nM lucKey. f, détection de RBD dans une matrice nasale simulée à 10 %. À gauche, la bioluminescence a été mesurée au fil du temps en présence de protéine RBD diluée en série. À droite, LOD a été calculé à 12 h. g, détection de la protéine de pointe dans un pool de sérum dilué à 20 %. À gauche, la bioluminescence a été mesurée au fil du temps en présence de protéine de pointe HexaPro diluée en série. À droite, LOD a été calculé à 47 pM. Toutes les expériences ont été réalisées en triple, sauf indication contraire, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

a, b, Évaluation expérimentale de l'effet de la longueur de lucKey (KCK) sur la plage dynamique (DR) de lucCageRBD pour détecter le SARS-CoV-2 RBD monomère. Une lucKey tronquée (lucKey courte), 14 résidus plus courts que la clé pleine longueur à son extrémité C (b), offre une meilleure plage dynamique que la lucKey pleine longueur (a) en raison d'un signal de fond réduit, comme prédit par la simulation dans Données étendues Fig. 1f, tandis que le LOD reste le même. c, L'effet de la concentration de lucKey sur la plage dynamique. La diminution de la concentration de lucKey augmente la plage dynamique de lucCageRBD en raison d'un signal de fond réduit, mais avec un signal de bioluminescence maximal réduit. d, e, lucCageRBD (1 nM) a été incubé avec 20 nM de RBD (d) ou 20 nM de protéine de pointe (e), qui devraient entraîner une reconstitution complète de l'activité de la luciférase. En présence de protéine de pointe, le même capteur n'a pas été en mesure de produire le signal bioluminescent maximal, ce qui suggère l'effet de facteurs non capturés par les simulations telles que l'encombrement stérique contre la reconstitution complète de la luciférase. f, lucCageHBVα (1 nM) incubé avec 50 nM de l'anticorps VHB HzKR127-3.2 montre une activation presque complète, mais un signal de fond élevé. g, lucCageTrop (1 nM) montre un signal de fond non idéal et une activation modérée axée sur la cible en présence de cTnI 20 nM. Toutes les expériences ont été réalisées en triple, des données représentatives sont présentées et les données sont moyennes ± sd

a, Les spectres d'émission bioluminescente de lucCageRBD (à gauche) en réponse à des concentrations variables de RBD. Antares2 est un système BRET CyOFP1-teLuc-CyOFP1 efficace40 avec un pic d'émission à 590 nm (milieu). Les spectres d'émission ont été enregistrés à partir d'un mélange de lucCageRBD et lucKey (tous deux à 1 nM), Antares2 (0,1 nM) et RBD à différentes concentrations (à droite). En acquérant le signal individuel des canaux 470/40 nm et 590/35 nm, les réponses intensiométriques de lucCageRBD ont été converties en lectures ratiométriques. b, Équations pour calculer le rapport spectralement non mélangé. Le signal total du canal 470/40 nm (T470) est la somme des signaux du capteur lucCageRBD (I470) et de la référence Antares2 (R470), et le signal total du canal 590/35 nm (T590) est égal au signal du capteur (I590) plus le signal de référence (R590). Étant donné que lucCageRBD donne une émission négligeable sur le canal 590/35 nm, T590 est approximativement égal à R590 (R590 >> I590). R470 est R590 × f, une constante prédéterminée pour Antares2, et donc le rapport non mélangé (I470/R590) pourrait être calculé en temps réel lors de l'acquisition du signal. La constante f pour Antares2 a été systématiquement déterminée à 0,43 en enregistrant le spectre complet ou à partir du jeu de filtres. c, des concentrations variables de RBD ont été dopées dans du sérum regroupé à 50 %, 25 % ou 10 % ou dans du liquide nasal simulé à 20 %. Les intensités absolues de bioluminescence et la cinétique d'émission étaient différentes d'une matrice à l'autre en raison de l'effet d'inhibition de la matrice et du renouvellement du substrat53. En revanche, l'étalonnage avec Antares2 a donné des signaux ratiométriques stables (I470/R590). d, L'intensité de la bioluminescence de lucCageRBD à la concentration saturante de RBD (courbe verte) est environ 20 fois plus élevée que le niveau de fond. Le rapport du rapport brut (T470/T590) en fonction de la concentration de RBD compromet la plage dynamique du capteur (courbe noire) en raison d'une émission notable au niveau du canal 470/40 nm (R470) d'Antares2. Après calcul et conversion du rapport non mélangé, la plage dynamique devient 20 fois supérieure au niveau de fond avec des lectures ratiométriques (courbe magenta). e, La détection de RBD dopé dans quatre sérums humains anonymisés différents (50 %) montre que l'étalonnage utilisant Antares2 spectralement résolu comme référence interne peut minimiser les variations de la bioluminescence intensiométrique dans ces matrices. Les signaux bioluminescents et sd ont été mesurés en triple, et un représentant est montré pour les spectres d'émission et la cinétique d'émission, respectivement. Les données sont moyennes ± sd

Ce fichier contient la discussion supplémentaire, les méthodes supplémentaires, les références supplémentaires, la figure 1 supplémentaire et les tableaux supplémentaires 1-6.

Réimpressions et autorisations

Quijano-Rubio, A., Yeh, HW., Park, J. et al. Conception de novo de biocapteurs de protéines modulaires et accordables. Nature 591, 482–487 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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Reçu : 13 juin 2020

Accepté : 19 janvier 2021

Publié: 27 janvier 2021

Date d'émission : 18 mars 2021

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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